油茶籽餅粕多糖的提取工藝優化及結構鑒定

郭玉華 徐云 張雪茹 金日生

摘要[目的]以油茶籽餅粕為原料，優化油茶籽餅粕多糖提取工藝，并對純化后的多糖進行結構鑒定。[方法]根據單因素試驗結果，以超聲時間10、15、20min;料液比1∶15、1∶20、1∶25;浸提溫度50、60、70℃;浸提時間60、90、120min為影響因素，多糖得率為指標，通過正交試驗設計優化提取工藝。粗多糖經脫色，脫蛋白處理后，再經過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂純化，并對純化多糖組分進行紫外光譜和高效液相色譜分析。[結果]超聲時間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時間120min為最佳工藝條件，此條件下油茶籽餅粕多糖的平均得率16.76%。粗多糖經脫色、脫蛋白、纖維素陰離子交換樹脂柱層析得到純化組分CCP。紫外光譜表明CCP為較純的均一多糖組分，高效液相色譜表明CCP的單糖組成為甘露糖和葡萄糖，其物質的量比為：1.91∶1.00。同時還含有少量的鼠李糖。[結論]該工藝優化合理，多糖的結構得到了初步的確證。研究為油茶籽餅粕多糖的后續理化活性分析、結構表征提供了理論依據。

關鍵詞油茶籽餅粕;多糖;工藝優化;分離純化;結構鑒定

中圖分類號TS201.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0167-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

油茶與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料植物。它生長在中國南方亞熱帶地區的高山及丘陵地帶，是中國特有的一種純天然高級油料。主要集中在浙江、江西、河南、湖南、廣西、安徽等地[1]。油茶籽粕為油茶籽榨取茶油后的餅粕，含有30%～50%的糖類物質[2]。茶籽粕中還含有茶皂素、茶籽蛋白等，它們都是化工、輕工、食品、飼料工業產品等的原料[3]，具有很高的綜合利用價值。

目前，對于多糖的提取方法主要是水體醇沉法，再以超聲[4]、微波[5]、酶法[6]等輔助提取，以提高多糖的得率和提取效率。超聲波輔助提取法可快速高效地從植物中提取有效成分，已應用于白及多糖[7]、紅腰豆多糖[8]等多種植物多糖的提取。多糖具有抗氧化[9]、增強免疫[10]、降血糖[11]等多種生物活性，其純度及結構對多糖的活性有顯著的影響[12]。目前，對于油茶籽餅粕多糖的分離純化及結構鑒定鮮有報道。作為油茶產業鏈的下游產物，從廢物再利用的角度出發，從中提取多糖有利于加深油茶的開發利用，進一步提高其應用價值和經濟價值。該試驗利用正交試驗法對油茶籽餅粕多糖的超聲波提取條件進行優化，并對其進行分離純化及其結構表征，以為油茶籽餅粕資源的深度開發利用提供理論基礎。

1.1材料與試劑

1.1.1試驗材料。油茶籽餅粕：源自安徽省金寨縣大別山。單糖標準品，DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂：Sigma公司;考馬斯亮藍染料，濃硫酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉均為分析純，國藥試劑有限公司生產。

1.1.2試驗儀器。亞榮RE-5286A電動升降旋轉蒸發儀（上海圣科儀器設備有限公司）;TG16-WS/TG16WS臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;FD-B10N-50冷凍干燥機（冠森生物科技有限公司）;752N紫外可見分光光度計（上海精科分析儀有限公司）;Nexus型傅里葉紅外變換光譜儀（美國Thermonecolet公司）;Aglient1100高效液相色譜儀（美國Aglient公司）。

1.2油茶籽餅粕總多糖的提取油茶籽餅粕→粉碎→過篩（40目）→按一定料液比加蒸餾水→超聲預處理→水浴浸提→離心取上清（4000r/min，10min）→濃縮至上清液體積的1/5→4倍上清液體積的無水乙醇沉淀→4℃冰箱沉淀過夜→離心（4000r/min，10min）→收集沉淀→冷凍干燥→得油茶籽餅粕多糖，收集備用。

1.3測定方法

以苯酚-硫酸比色法[13]繪制葡萄糖標準曲線，總糖質量濃度（C）與吸光度（A）之間的回歸方程為Y=7.452C+0.002（R2=0.997）。將水體醇沉法得到的粗多糖溶于一定體積的蒸餾水中，并進行稀釋，在495nm處測定溶液的吸光度，按照回歸方程計算溶液的質量濃度，并按下式計算多糖得率：

T（%）=V×C×N/M0

式中，T為多糖得率;V為粗多糖溶液的體積;N為稀釋倍數;C為多糖質量濃度;M0為油茶籽餅粕粉末的質量。

1.4提取單因素試驗

取10g油茶籽餅粕粉末，固定料液比1∶10，浸提溫度40℃，浸提時間30min，分別在超聲時間為5、10、15、20、25min的條件下測定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時間5min，浸提溫度40℃，浸提時間30min，分別在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的條件下測定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時間5min，料液比1∶10，浸提時間30min，分別在浸提溫度40、50、60、70、80℃的條件下測定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時間5min，料液比1∶10，浸提溫度40℃，分別在浸提時間30、60、90、120、150min的條件下測定油茶籽餅粕粗多糖的得率。

1.5提取正交試驗設計

試驗設計超聲時間、料液比、浸提溫度、浸提時間四因素，每個因素設計3個水平，具體試驗設計見表1。

1.6油茶籽餅粕粗多糖的分離純化

1.6.1粗多糖前處理。

取冷凍干燥后的多糖適量，溶于水中，以Sevag法脫蛋白[14-15]，10%過氧化氫脫色后[16]，在經3500Da透析袋流動水透析48h，收集透析液，冷凍干燥后備用。

1.6.2DEAE纖維素陰離子樹脂的活化。取25gDEAE于燒杯中，加入250mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置浸泡24h。將蒸餾水抽干，溶脹樹脂置于燒杯中，加入0.5mol/LHCl溶液，攪拌，靜置浸泡1.5h，抽干后用蒸餾水反復洗滌至中性。再將溶脹樹脂置于燒杯中加入0.5mol/LNaOH溶液，攪拌，靜置浸泡1.5h，抽干后用蒸餾水反復洗滌至中性，待用。

47卷1期郭玉華等油茶籽餅粕多糖的提取工藝優化及結構鑒定

1.6.3裝柱與平衡。將層析柱洗凈固定于鐵架臺上，加入1/3體積的去離子水，將抽干的樹脂加入少量蒸餾水，超聲攪拌均勻后，迅速倒入層析柱中，直至樹脂填滿層析柱2/3左右，停止裝柱，并打開下部旋鈕，調整流速。保持柱子表面平整，以4倍柱體積的蒸餾水平衡后，關閉下部旋鈕，待用。

1.6.4上樣與純化。

將多糖液緩慢加入平衡好的DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂柱中（2.4cm×40cm），小心防止打亂上層平整的樹脂表層，上樣量為200mg。用0.3mol/LNaCl洗脫，每10mL接1管，洗脫60管。每管用苯酚硫酸法檢測并記錄溶液在495nm處的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，洗脫體積為橫坐標作洗脫曲線。合并吸光度峰值附近的洗脫液，冷凍干燥，得到精制多糖組分，并命名為CCP。

1.7CCP的紫外光譜掃描

稱取適量的油茶籽餅粕多糖CCP溶于蒸餾水中，制成5mg/mL多糖液，于190～800nm處進行紫外光譜掃描。

1.8CCP的單糖組成分析

1.8.1混合單糖標準品的衍生。分別取100μL的混合單糖標準溶液，與100μL的0.3mol/LNaOH溶液，置于1mL的具塞試管中，加入100μL0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）甲醇溶液后渦漩混勻。在80℃水浴反應120min，冷卻至室溫;加100μL0.3mol/LHCl溶液中和。再加入1mL積氯仿，萃取3次，以除去未反應的PMP，將下層水相用0.45μm濾膜過濾后，供HPLC進樣分析[17-19]。

1.8.2樣品制備。

吸取100μL0.2mg/mL的CCP溶液于具塞試管中，加入100μL4mol/L三氟乙酸（TFA），充氮封管，114℃油浴2h;冷卻后加200mL甲醇，并用氮氣吹干。重復3次，加入100μL蒸餾水溶解用氮氣吹干的水解多糖，并置于10mL具塞試管中，備用。然后按照1.8.1的衍生方法進行處理。

色譜條件：色譜柱ZORBAXEclipseXBD-C18250mm×4.6mm5μm;流動相：0.2mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.7）-乙腈（體積比83∶17）;柱溫：30℃;檢測波長250nm;流速為1mL/min;進樣體積20μL[17]。

2結果與分析

2.1提取單因素試驗

由圖1可知，隨著超聲時間的增加，多糖的得率不斷提高，當超聲時間增加到20min時，多糖的得率達到最高，之后隨著時間的增加，多糖得率上升并不明顯。故選擇超聲時間20min作為適宜的處理時間，并選擇10、15、20min作為正交試驗的3個水平。

由圖2可知，隨著料液比例的增加，多糖的得率呈現先快速上升后趨于平緩的趨勢，比例為1∶25時多糖的得率達到最高之后不再增加。故選擇料液比例為1∶25時作為適宜的提取比例，并把料液比1∶15、1∶20、1∶25作為正交試驗的3個水平。

由圖3可知，隨著浸提溫度的不斷升高，多糖的提取率不斷增大，當浸提溫度達到70℃時，多糖的得率達到最高水平并趨于平穩，但是浸提溫度為60和70℃時，多糖的提取率差異很小。故從經濟和效率的角度考慮，以60℃作為適宜的浸提溫度，并把50、60、70℃作為正交試驗的3個水平。

由圖4可知，隨著浸提時間的不斷增加，多糖的得率不斷提高，當浸提時間達到120min時，多糖得率達到較高水平，并趨于平穩。故把浸提時間120min作為適宜的提取時間，并以60、90、120min作為正交試驗的3個水平。

2.2提取正交試驗結果與分析

由表2、表3可以看出，各影響因素的極差與顯著性得出的結果基本一致。多糖得率影響因素的大小順序為C>B>D>A，即浸提溫度>料液比>浸提時間>超聲時間。B、C和D3個因素對提取多糖得率均有較顯著的影響。其中浸提溫度對多糖得率的影響最大，一般來說溫度越高提取率越高，因為溫度越高，分子運動加快，滲透、溶解、擴散速度加快，因而提取率提高[19]。但溫度過高，會破壞有效物質的活性，增加雜質的含量。超聲波可以起到破壁的作用，一定程度上促進目標物質的溶出，但試驗結果表明，過長的超聲時間并不能持續促進多糖的提取率提高。因此，超聲時間不宜過長。故綜合考慮，最終確定最佳提取工藝條件為A1B2C2D3，即超聲時間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時間120min。按照此組合進行3次平行驗證試驗得知，油茶籽餅粕多糖的平均得率為16.76%。高于表中的任意組合，因此認為該工藝優化合理，穩定可行。

2.3油茶籽餅粕多糖的分離純化及鑒定DEAE-纖維素（二乙氨乙基纖維素，Dicthylaminoethyl）在纖維素上結合了帶正電荷的陽離子，可與帶負電荷的陰離子進行交換，交換劑對多糖和無機陰離子均有交換吸附的能力，兩者同時存在于一個色譜過程中[20]。一般采用一定離子濃度的洗脫液和DEAE-纖維素交換劑洗脫達到分離多糖的目的。圖5為纖維素DEAE-52交換樹脂對油茶籽餅粕粗多糖的分級洗脫曲線。洗脫液為0.3mol/LNaCl溶液，收集尖峰及附近幾管洗脫液，冷凍干燥并命名為CCP。

由圖6可知，195nm左右處具有糖類物質特征吸收峰[21]。其在260、280、420nm處并無顯著的吸收峰，已知的核酸、蛋白質、多肽的吸收峰值分別是260、280、420nm[22]。說明所提取純化的多糖組分CCP較純，幾乎不含有蛋白質核酸和多肽類雜質。

糖類化合物一般常采用衍生化方法使其形成具有紫外或熒光吸收的衍生物來提高其在HPLC檢測中的靈敏度。已成功用于多糖化合物的單糖組成分析[23]。圖7為標準單糖的高效液相色譜圖，對比圖7，從圖8可以看出，PMP柱前衍生法高效液相色譜分析可知，多糖組分CCP其單糖組成為甘露糖、葡萄糖以及極少量的鼠李糖。測定結果與已知的報道大體一致。

3結論

試驗選取超聲時間、料液比、浸提溫度和浸提時間4個因素，根據單因素試驗結果進行正交試驗設計，通過直觀分析和方差分析優選工藝參數，結果表明，油茶籽餅粕多糖提取工藝優化合理，得到的最佳優化工藝參數為超聲時間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時間120min。在此條件下多糖的平均得率為16.76%。試驗為油茶籽餅粕多糖提取提供了行之有效的方法。油茶籽餅粕多糖經過DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析得到純化組分CCP，梯度洗脫是多糖純化的主要手段之一，該試驗選取0.3mol/LNaCl作為洗脫劑，進一步研究可以擴大NaCl的濃度范圍，以期獲得油茶籽餅粕中不同洗脫多糖組分。紫外和高效液相分析表明，在CCP為較純的均一多糖，其單糖組成較為單一，含有甘露糖和葡萄糖，其物質的量比為1.91∶1.00。同時還含有極少量的鼠李糖。研究為開發利用油茶籽餅粕多糖提供了理論基礎。然而關于油茶籽餅粕多糖的進一步結構表征還有待于更加深入的研究。

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