西瓜炭疽病接種技術規程

魏春華 郜森 甘露 羅婷 張勇 李好 馬建祥 楊建強 張顯

摘 要： 西瓜是我國重要的葫蘆科經濟作物。炭疽病作為一種在西瓜整個生長期廣發的真菌性病害，已嚴重影響了我國西瓜產業的健康可持續發展。現根據西瓜炭疽病的生物學特性，結合已有的研究成果，對西瓜炭疽病的危害癥狀、病原菌形態學特征、西瓜炭疽病病菌的分離及培養、人工接種鑒定技術等作了描述和規定，并制定了西瓜炭疽病接種技術規程。

關鍵詞： 西瓜； 炭疽病； 人工接種； 鑒定標準； 技術規程

西瓜是葫蘆科重要的經濟作物，是世界第五大水果。我國是最大的西瓜生產和消費國。據中國農業統計資料顯示，2016年我國西瓜的種植面積為189.08萬hm2，總產量高達7 940萬t。因此，西瓜在我國農業結構調整和農民增收中發揮著重要的作用[1]。

炭疽病作為一種真菌性病害，在西瓜的整個生長期都可發生，其對西瓜的危害僅次于枯萎病。西瓜炭疽病由瓜類炭疽病菌[Colletorichum lagenerium （Pass.） Ell.et Halst]引起，屬半知菌亞門，黑盤孢目，刺盤孢屬真菌。目前，已知的瓜類炭疽病菌有7個生理小種，其中生理小種1和3對西瓜的危害最大[2]。不同的生理小種可通過特定的鑒別寄主進行鑒定。潮濕環境可引起該病的大規模爆發，造成西瓜減產，甚至絕收[3]。因此，種植戶在防治過程中，往往會濫用化學農藥，不僅造成投入成本的增加，同時也在一定程度上影響了西瓜的品質，甚至對生態環境造成破壞。而抗性品種的選育將在根源上解決這一生產難題。基于此，筆者根據西瓜炭疽病的生物學特征及病害癥狀，結合已有的研究基礎制定了西瓜炭疽病的人工接種鑒定技術規程，該規程經多次應用驗證，適合于西瓜炭疽病的鑒定，為抗病種質的篩選提供可靠的參考依據。

1 西瓜炭疽病病害癥狀

葉片染病初期為黃色水漬狀圓形小斑，后小斑逐漸擴展并附有同心輪紋，病斑直徑0.5～1.5 cm，易穿孔，呈褐色且外緣常伴有黃色暈圈（圖1）。通常病斑顏色較為均勻，上面有散生黑色小點，當環境濕度增大時，會出現粉紅色黏稠狀膠狀物。后期病葉由于病斑易干枯破碎而早衰。若葉柄或蔓上染病，初期呈現水浸狀黃褐色的梭形或長橢圓凹陷病斑，后病斑逐漸擴大并轉變黑褐色，最后引起莖蔓逐漸死亡。若果柄染病，初期幼果顏色深暗，后逐漸萎縮致死。若果實染病，初期為暗綠色油漬狀小斑點，后逐漸擴大成表面凹陷并附有輪紋的圓形暗褐色病斑，通常隨著病斑的生長，在中央會出現龜裂（圖1）。當空氣濕度大時，病斑上出現黑色小顆粒，并有粉紅色黏稠的分生孢子團，嚴重時，病斑連片，西瓜腐爛，失去商品性，從而造成西瓜減產[4]。在西瓜的貯放或運輸過程中，炭疽病也時常發生，從而造成西瓜腐爛、變質失去商品價值，造成損失。

2 西瓜炭疽病病原菌形態學特征

西瓜炭疽病通常由瓜類炭疽病生理小種1或3引起。瓜類炭疽病菌分生孢子盤生有黑褐色剛毛，長90～120 ?m，具有2～5個隔膜，初期埋于寄主表皮下，成熟后突破表皮外露（圖2）。其分生孢子梗無色，單孢呈圓筒狀，大小為（20～ 26） ?m×（2.6～3.0） ?m。分生孢子無色，單孢為卵圓或長圓形，具有2～3個橫膈膜，大小為（14～20） ?m×（5～6） ?m，多個孢子聚合一起形成粉紅色黏孢子團。

隨著炭疽病菌在培養基上不斷生長，菌落逐漸形成。培養2～3 d后，菌落為乳白色且有絨毛狀的氣生菌絲；3～5 d后，菌落在增大的同時變為粉紅色，顏色從中心到邊緣漸淺；5～7 d后，菌落顏色由中心至邊緣變為深灰色，邊緣波狀，出現同心輪紋；7～12 d后，菌落變為深灰色，且邊緣有一圈淡粉色暈圈；在培養12～15 d后，菌落出現紅褐色黏稠狀孢子團。

3 西瓜炭疽病的分離及培養

抗病材料的篩選無疑會為西瓜抗炭疽病品種的選育提供重要的材料資源。不同西瓜材料對炭疽病抗性的鑒定可分為自然條件下的抗性鑒定和人工接種抗性鑒定，前者受環境因素的影響較大，且周期長、不定因素較多，不易控制；而后者可顯著地縮短鑒定周期，且可減少環境因素的影響，故可相對準確地鑒定出不同材料對炭疽病的抗性。但瓜類炭疽病菌在普通的培養基上只長菌絲而少產孢子。因此，如何在短期內獲得足夠的炭疽病孢子就成為了人工接種鑒定材料抗病性的關鍵步驟[6]。

3.1 病原菌分離

從田間采集病葉（或其他感病組織），先經過0.1% HgCl2消毒2 min，再用滅菌的蒸餾水沖洗3～4次后，放置在已經過高溫滅菌的鋪有濾紙的培養皿中，保濕2～3 d后，挑取少量產生的孢子于無菌水中制成孢子懸浮液。用接種環接種少量孢子懸浮液于PDA培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。待病原菌在恒溫培養箱培養2～3 d，長成為直徑約1 cm的菌落后，目鏡檢測，并挑取邊緣少量菌絲于新的PDA培養基上，進行二次轉接培養。如此經過3～4次轉接后，可使菌種得到純化。每次轉接前，需對菌落形態和顏色進行觀察，同時鏡檢，確認為西瓜炭疽病菌。

3.2 病原菌回接鑒定

在抗性鑒定之前，為確保分離得到的是西瓜炭疽病病原菌，將分離純化的病原菌配成1×106個·mL-1的孢子懸浮液。采用噴霧法將孢子懸浮液接種于感病材料‘玲瓏王的西瓜幼苗上，20株為1組，重復3次。將接種后的西瓜幼苗置于24～26 ℃、相對濕度（RH）為95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后，再置于正常的生長環境中，觀察發病情況。

3.3 病原菌孢子繁殖

為獲得用于抗病性鑒定的大量孢子懸浮液，將上述經過回接驗證的孢子用無菌蒸餾水懸浮后（或直接挑取少量菌絲），接種于培養基上置于25 ℃恒溫培養箱中培養。試驗表明，接種于西瓜皮培養基上再培養10 d左右，即可獲得粉紅色孢子團；而在PDA培養基需要培養12～15 d才可產孢子。因此在有果實的季節，推薦使用西瓜果皮培養基；其他時候推薦PDA培養基。

西瓜果皮培養基配方：200 g西瓜果皮煮汁+15 g瓊脂，定容至1 L；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基配方：去皮馬鈴薯200 g，加水1 L，煮沸30 min，紗布過濾后+20 g葡萄糖+ 15 g瓊脂，定容至1 L。

4 西瓜炭疽病人工接種

將擴繁的孢子團用無菌蒸餾水稀釋至1×106個·mL-1，以無菌水為對照。采用噴霧法接種于待鑒定的不同西瓜種質幼苗（2葉1心時期），以15～25株幼苗為1組，重復3次，采用隨機區組試驗法。接種后的幼苗置于24～26 ℃、相對濕度（RH）為95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后，置于正常生長條件下。接種3 d后，觀察感病情況。根據劉莉等[7]研究，計算病情指數（DI）。

離體葉人工接種方法同樣能夠真實地鑒定西瓜種質的抗病性[8]。選取葉齡為15～20 d的真葉（剪口用石蠟固封），同樣將孢子團用無菌蒸餾水稀釋至1×106個·mL-1，以無菌水為對照，采用微量注射器進行懸滴法接種（30滴左右）。將接種后的葉片放置于4層飽和吸水（無菌水）的濾紙上，并用塑料薄膜覆蓋保濕（相對濕度100%）后，置于滅菌后的培養皿中。在24～26 ℃的培養箱中黑暗處理24 h后，置于正常生長條件下，6 d后觀察發病情況。采用平均病斑直徑法（Average Diameter of Lesion，簡稱AD）進行發病統計[8]。

5 西瓜炭疽病的鑒定標準

參考劉莉等研究[7]，根據葉片病斑數目及植株整體生長情況，將西瓜幼苗對炭疽病的抗性分為6個等級：0、1、3、5、7、9。0級：無病斑；1級：輕微侵染，僅子葉上有少數小病斑（1～5個）；3級：中度侵染，真葉發病，少數病斑（6～10個）；5級：嚴重侵染，病斑較多（11～20個）；7級：侵染非常嚴重，壞死斑擴大；9級：發病嚴重，植株死亡。病情指數（DI）計算公式如下：

DI=[各病情指數×該病情代表數最高病級代表數×調查總株數][×]100

其抗性分級標準：0為免疫；11%以下為高抗；12%～33%為抗病；34%～55%為輕度抗病；56%～77%為感病；78%以上為高感。

鑒于上述鑒定方法在等級劃分時，存在人為主觀造成的試驗誤差且數據計算復雜，故建議采用平均病斑直徑法（AD）進行發病統計[8]。病情指數（AD）計算公式如下：

AD=[發病病斑直徑/mm接種總滴數]

其中分子為各病斑直徑的總和，而分母為接種總滴數，包括發病接種滴數和未發病接種滴數。根據AD值，按以下抗性分級標準對材料炭疽病抗性進行劃分：0.0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗病；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感病；>3.01 mm，高感。

本技術規程對西瓜炭疽病的形態學特征和病害癥狀進行了詳細描述，同時對病原菌的擴繁、接種方法及抗病鑒定指標進行系統性規范。該技術規程的制定，將為炭疽病抗性種質資源的篩選提供技術指導，進而為抗性新品種的選育奠定基礎。

參考文獻

[1] 農業部. 2016年全國各地蔬菜、西瓜、甜瓜、草莓、馬鈴薯播種面積和產量[J]. 中國蔬菜，2018（1）： 18.

[2] 崔麗紅，黃蔚，成娟. 西瓜抗炭疽病遺傳育種的研究進展[J]. 貴州農業科學，2014（8）： 172-174.

[3] 梅麗艷，王喜慶，賈云鶴，等. 西瓜炭疽病癥狀觀測及發生危害調查[J]. 黑龍江農業科學，2016（12）： 55-58.

[4] 韓華，崔志紅. 西瓜常見病害及其綜合防治技術[J]. 安徽農學通報，2008，14（3）： 141-141.

[5] 羅婷. 西瓜苗期炭疽病抗性鑒定方法及其抗病機理研究[D]. 陜西楊凌：西北農林科技大學，2008.

[6] 劉志恒，唐爽爽，楊璐，等. 西瓜炭疽病菌圓刺盤孢分生孢子產生條件的研究[J]. 菌物學報，2015（1）： 75-81.

[7] 劉莉，王鳴. 西瓜種質資源苗期對炭疽病抗性的研究[J]. 中國西瓜甜瓜，1990，3（1）： 9-13.

[8] 文生倉，王鳴. 西瓜炭疽病人工接種鑒定的新方法──離體葉接種和AD評價法[J]. 西北農業大學學報，1994，22（1）： 17-22.