高效液相色譜法測定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量

廖汝丹 黃水心

摘要：目的?采用高效液相色譜法測定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量。方法?用薄層色譜法對其君藥黃芩中的主要成分黃芩苷進行鑒別;以高效液相色譜法對黃芩苷進行定量分析，色譜柱為CAPCELL PAK-C18柱（4.6mmL×250mm，5μm），柱溫30℃，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）為流動相，流速為1mL/min，檢測波長為276nm.結果?薄層色譜無干擾，專屬性強。 黃芩苷濃度在0.10048μg/mL～1.0048μg/mL范圍內線性關系良好，得回歸方程y=3471.6X-1.8909（r2=1），平均加樣回收率為102.15%，RSD為0.129%（n=6）。 結論?所用方法簡便、準確、重現性好，可用于咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量測定。

關鍵詞：咳喘停袋泡顆粒;黃芩苷;高效液相色譜法;含量測定

中圖分類號：R927.2?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2019）03-0074-04

咳喘停袋泡顆粒為玉溪市中醫醫院院內制劑，主要成分：金銀花、連翹、黃芩、葶藶子、陳皮、甘草等。功能主治：清熱化痰，肅肺止咳，用于痰熱型急慢性支氣管炎。據臨床研究表明[1-3]：咳喘停袋泡顆粒廣泛應用于臨床，治療慢性支氣管、肺心病急性發作期、熱哮型支氣管哮喘、特發性肺間質纖維化等。黃芩為本方的主藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，黃芩苷是其主要有效成分。 為了保證服用咳喘停袋泡顆粒的安全性以及有效性，提高院內制劑的臨床指導用藥，本文將黃芩苷作為測定指標，對其進行薄層色譜鑒別，并采用HPLC法對其質量標準進行研究。

1?儀器與試藥

儀器：1260型高效液相色譜儀（四元泵帶真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、儀器控制及數據處理）;BSA224S-CW電子天平、BP211D-OCE電子天平;cpx5800H-C超聲波清洗儀、PURELAB FLEX超純水儀。

試藥與試劑：黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201720，含量為93.5%）;咳喘停袋泡顆粒（玉溪市中醫醫院制劑室）;硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）;甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2?方法選擇與結果

2.1?定性鑒別[ 10]?取本品粉末 3.5g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液 。另取黃芩苷對照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2?色譜條件?色譜柱：CAPCELL PAK-C18（4.6×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）;檢測波長：276 nm;理論塔板數按黃芩苷峰計算不低于5000[8-9]。

2.3?測定波長確定?取對照品溶液，以70%乙醇溶液為空白對照，在紫外光200 nm～400 nm波長范圍內進行掃描，黃芩苷對照品溶液在276 nm波長處有最大吸收，且無干擾。故選擇276 nm為檢測波長。

3?溶液的制備 [10]

3.1?對照品溶液的制備?（1）取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.1 μg/mL的對照品溶液。（2）取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成50 μg/mL的對照品溶液。

3.2?供試品的制備?取本品3.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

3.3?陰性對照溶液的制備?取缺黃芩的其他組分，按處方工藝制成陰性制劑，按“3.2”項下方法制成陰性對照溶液。

4?方法學考察

4.1?專屬性試驗?分別精密吸取3.1.1項下的對照品溶液、3.2項下的供試品溶液、3.3項下的陰性對照溶液各10μL進樣，分別注入液相色譜儀，在2.2色譜條件下，樣品中黃芩苷色譜峰與對照品黃芩苷色譜峰保留時間相近，陰性對照溶液在黃芩苷色譜峰相應位置上無色譜峰出現，證明無干擾。

4.2?線性范圍考察 精密吸取3.1.2項下制備的黃芩苷對照品溶液，進樣量分別為2、4、6、8、10、15、20 μL，注入色譜儀，以待測組分的質量為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行線性回歸考察。得回歸方程y=3471.6X-1.8909（r=1），結果表明黃芩苷在0.10048 μg/mL～1.0048 μg/mL范圍內線性關系良好。

4.3?精密度試驗?精密取3.1.1項下制備的同一對照品溶液10μL，連續進樣6次，記錄峰面積。結果樣品溶液中黃芩苷峰面積的RSD為0.365%，說明精密度良好（n=6）。見表1。

4.4?穩定性試驗?精密吸取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進樣，依照樣品含量測定項下方法測定峰面積。結果24 h內RSD為 0.06%，說明咳喘停袋泡顆粒樣品溶液在24 h內穩定性良好。見表2。

4.5?重復性試驗?取同一批號的咳喘停袋泡顆粒樣品，精密稱取3.5 g，平行制備6份供試品溶液，每份進樣3次，測定峰面積，RSD值為0.320%，表明重現性良好。見表3。

4.6?加樣回收試驗?精密稱取樣品0.3 g，共6份，按3.2項下的方法制備供試品溶液，分別精密加入3.1.2項下制備的濃度相同的黃芩苷對照品溶液3.27 mL，進樣量10 μL，測得平均回收率為102.15%，RSD為0.129%。見表4。

5?樣品含量測定

取3批咳喘停袋泡顆粒，按3.2項下方法制備供試品溶液，每份進樣3次，每次取10 μL注入液相色譜儀進行測定，結果得咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的平均含量為5.45 mg/g。見表5。

6?實驗結果

HPLC法測定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷含量的方法學考察結果表明，在276 nm檢測波長下，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）為流動相，C18為固定相，該方法在線性范圍內線性關系良好，重復性和穩定性良好。該方法簡便、準確、重復性好，空白無干擾，可作為咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷含量測定的定量方法，為醫院制劑提供快速準確的測定方法。

7?討論

7.1?供試品提取方法的考察?分別采用以70%甲醇為溶劑進行超聲、以及用乙酸乙酯萃取和用甲醇加熱回流對供試品進行提取，結果用70%甲醇做溶劑峰形良好，分離度好，有效成分含量相對較高，操作方便。

7.2?定性鑒別?采用不同的展開系統以及不同的薄層板對供試品中的黃芩苷進行鑒別，結果在以聚酰胺薄膜為薄層板，醋酸為展開劑，1%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑條件下，斑點顯色清晰，效果相對較好，其Rf值為0.67。

7.3?測定波長的選擇?采用紫外分光光度計對黃芩苷對照品進行掃描（400.0 nm-200.0 nm），在276nm處有最大吸收，故采用該波長作為檢測波長。

7.4?色譜柱的選擇?取同一供試品溶液，采用長度不同的色譜柱進行測定：150 mm和250 mm，結果采用長柱250 mm分離效果較好，峰面積穩定，保留時間相近。

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