納米鐵聯合氧化石墨烯對垃圾堆肥基質高羊茅生理生態的影響

路國華,趙樹蘭,多立安

天津師范大學生命科學學院,天津市動植物抗性重點實驗室,天津 300387

隨著我國人口數量和人民生活水平的提高,城市生活垃圾的產生量與日俱增。截止到2015年底,生活垃圾產生量已從1980年的每天0.5 kg/人增加到2015年的1.2 kg/人,較過去30年增長了一倍,如何處理快速增長的生活垃圾已成為亟待解決的環境問題之一[1]。生活垃圾堆肥化利用是實現垃圾減量化和資源化的有效方式。垃圾堆肥含有大量的有機質和植物生長所需的營養物質,可以提高土壤肥力,改善土壤理化性質,促進植物生長,提高作物產量[2]。然而,由于我國未實行垃圾分類,垃圾堆肥中重金屬含量較高,長期施用會導致土壤重金屬含量升高,并通過植物吸收進入食物鏈,危害人類健康,從而限制了垃圾堆肥的應用[3]。

另一方面,隨著我國城市的快速發展,人們對園林綠化和生態環境的要求不斷提高,草坪作為園林綠化的一部分發揮著極其重要的作用。目前,城市草坪建植的多種方式之中,規?；a地毯式草皮被普遍采用。但地毯式草皮生產一般選擇農田的優質耕層土壤作為基質,幾次生產過后,優質耕層土壤隨草皮被帶走,因而這種草皮生產方式存在著消耗土壤資源、破壞農田生態環境及草皮雜草難控制等弊端[4]。近年來,國內外利用工農業廢棄物為土壤替代基質進行無土草皮生產展開了一系列的研究,以探討不同土壤替代基質對草皮性狀的影響[5-7]。趙樹蘭等[8]以生活垃圾堆肥代替土壤作為草皮培養基質,與園土基質草皮的相關生長參數進行了比較研究,表明以生活垃圾堆肥為基質的無土草皮性能符合草皮培植技術性能要求。雖然生活垃圾堆肥可作為基質用于草皮生產,但基質中的重金屬問題未得到根本解決,仍存在污染地下水、影響植物生長的風險。因此,若能解決草坪堆肥基質中重金屬問題,堆肥基質草坪建植體系的應用方式將會更加安全有效。

鈍化法是一種從生物可利用態向穩定態重金屬轉移的技術方法,被廣泛應用于重金屬污染土壤的修復[9-10]。零價納米鐵(nZVI)具有粒徑小、比表面積大兼具吸附性與還原性強等特點,其在水中具有較強去除重金屬能力,被認為是處理污染土壤與地下水的有效選擇[11-13]。氧化石墨烯(GO)具有相對較大的比表面積,其表面存在豐富的含氧官能團,可以快速高效去除水中重金屬離子,由于其獨特的物理化學特性,是一種極好的吸附劑[14]。兩種材料對重金屬的吸附能力較強,具有鈍化修復堆肥重金屬的潛力。但是,向堆肥基質中添加外源物質同樣可能會影響植物的正常生長,而其對草坪植物生長的影響尚未見文獻報道。

因此,本研究選擇生活垃圾堆肥作為高羊茅培養基質,通過室內盆栽試驗,研究草坪基質中添加GO和不同比例nZVI對高羊茅生長和生理特性的影響,為nZVI聯合GO安全有效地應用于堆肥基質重金屬的鈍化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生活垃圾堆肥來自天津市小淀垃圾堆肥處理廠。試驗前對堆肥進行預處理,去除其中的塑料薄膜、磚瓦、石塊和玻璃等雜物,風干后,過2 mm篩。堆肥理化性質為：pH 7.62,有機質含量221.25 g/kg,全氮13.48 g/kg,有效磷0.078 g/kg,C/N為8.37,飽和含水量0.76 mL/g；重金屬(Cd、Cr、Cu、Pb、Zn)含量分別是1.97、67.00、239、172、496 mg/kg。高羊茅(Festucaarundinacea)種子購買于天津曹莊花卉市場。

供試多層氧化石墨烯(GO)購自蘇州碳豐石墨烯科技有限公司,厚度為3.4—8 nm,片層直徑為10—50 μm,層數為5—10層,比表面積為100—300 m2/g。納米鐵購自于清河縣科工冶金材料有限公司,粒徑為50 nm。

1.2 試驗設計

取堆肥100 g,按一定比例加入鈍化材料混勻后,分別放入直徑6.3 cm、高6.8 cm的塑料盆中,作為高羊茅培養基質。試驗處理如下：①添加1% nZVI(N1)；②添加3% nZVI(N3)；③添加5% nZVI(N5)；④添加1% GO(G)；⑤添加1% GO+1% nZVI(GN1)；⑥添加1% GO+3% nZVI(GN3)；⑦添加1% GO+5% nZVI(GN5),以不添加鈍化劑的純堆肥為對照(CK),每個處理4次重復。將300粒大小均一、籽粒飽滿的高羊茅種子均勻播撒于基質上。培養期間定期澆水,使含水量保持在最大田間持水量的60%。植物培養期間的環境溫度為13—25℃,相對濕度為15%—31%,光照為透入室內的自然光。

1.3 指標測定

1.3.1種子萌發相關指標測定

種子從第4天開始萌發,每天記錄萌發的種子數。萌發10 d時,測定發芽率、發芽勢和發芽指數。發芽率Gr(%)=(發芽種子數/供試種子數)×100；發芽勢(%)=(萌發起4 d內發芽種子數/供試種子數)×100；發芽指數GI=∑(Gt/Dt),式中Gt為在t日的發芽種子數,Dt為相應的發芽天數。

1.3.2地上生物量測定

在播種第50 d時收獲植物地上部分,在108℃下殺青20 min,80℃條件下烘干至恒重后稱量。

1.3.3葉綠素含量的測定

稱取新鮮葉片0.5 g,剪成1—2 mm碎片,浸泡于20 mL丙酮∶乙醇(1∶1)溶液中24 h,浸泡液為待測液。取上述浸泡液1 mL,加丙酮4 mL稀釋后轉入比色杯中,以丙酮為對照,用紫外可見分光光度計分別測定663、645 nm處的OD值,計算葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量。

1.3.4保護酶活性與丙二醛含量的測定

保護酶活性的測定：取新鮮草樣0.5 g,加入預冷的研缽中,加入pH 7.8的磷酸緩沖液5 mL,少量石英砂,在冰浴下研磨成漿；再加入5 mL磷酸緩沖液研磨,定容到15 mL的離心管中。在4℃,8000 r/min下離心30 min,上清液用于保護酶活性的測定。POD活性的測定采用愈創木酚法[15],CAT活性測定采用紫外分光光度法[16],POD和CAT的活性單位(U)定義為：每克鮮質量每分鐘分別使OD470和OD240增加0.1的酶量為一個酶活性單位。SOD活性測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法[17],以每克鮮質量抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸氧化法。取葉片0.5 g,剪碎,加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨,再加入8 mL TCA充分研磨,勻漿以4000×g離心10 min。取2 mL上清液,加入2 mL 0.6%TBA液,混勻,在試管上加蓋塞,置于沸水浴中煮沸15 min,迅速冷卻后離心,對照以4 mL去離子水代替提取液。取上清液,用紫外分光光度計(SHIMADZU UV- 1700)測定532和450 nm處的OD值。計算MDA濃度,折算成每克鮮重質量組織MDA含量。

1.3.5重金屬含量的測定

準確稱取高羊茅地上部干重0.1 g,加入硝酸和雙氧水(5∶1),在120—140℃下消解,過濾后用1% HNO3溶液定容至25 mL,用原子吸收光譜儀測定植物體內重金屬(Cu、Cd、Pb、Zn、Cr)含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行單因素方差分析,并采用Turkey法,在P=0.05水平進行數據差異顯著性檢驗,采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 鈍化劑對高羊茅種子萌發的影響

播種4 d后,高羊茅種子開始萌發,10 d時達到萌發穩定。如表1所示,單獨添加nZVI對高羊茅種子萌發無顯著影響。添加GO后,發芽率、發芽勢和發芽指數均顯著提高,且隨著nZVI添加比例的增加而增加。發芽率與發芽指數均在GO+5% nZVI處理中達到最高,較對照分別提高了109%和108%。發芽勢在1% GO處理中達到最大,較對照提高了92%。

表1 鈍化劑對高羊茅種子萌發的影響

CK：對照,control；N1：1%納米鐵,1% nanoscale iron；N3：3%納米鐵,3% nanoscale iron；N5：5%納米鐵,5% nanoscale iron；G：1%氧化石墨烯,1% graphene oxide；GN1：1%氧化石墨烯+1%納米鐵,1% graphene oxide+1% nanoscale iron；GN3：1%氧化石墨烯+3%納米鐵,1% graphene oxide+3% nanoscale iron；GN5：1%氧化石墨烯和5%納米鐵,1% graphene oxide+5% nanoscale iron；不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=4)

2.2 鈍化劑對高羊茅地上干重及葉綠素含量的影響

添加鈍化劑對高羊茅地上干重和葉綠素含量的影響如表2所示。除1% nZVI對高羊茅地上干重無顯著影響外,單獨添加3%、5% nZVI及聯合GO處理均顯著促進了地上生物量的積累,在GO+5% nZVI處理下達到最大,較對照增加25%。

各鈍化劑處理葉綠素a與總葉綠素含量均顯著高于對照,且隨nZVI添加比例的升高呈現增加的趨勢,總葉綠素含量在GO+5% nZVI處理達到最大,比對照提高了31%。與葉綠素a和總葉綠素含量不同的是,鈍化劑的添加顯著降低了葉綠素b含量。

表2 鈍化劑處理對高羊茅地上干重及葉綠素含量的影響

2.3 鈍化劑對高羊茅保護酶活性和丙二醛含量的影響

鈍化劑對高羊茅保護酶活性和丙二醛含量的影響如圖1所示。單獨添加nZVI 處理POD活性隨添加比例的增加而升高,3%和5% nZVI處理分別顯著高出對照42%和55%；共同添加GO和3%、5% nZVI處理,POD活性顯著高于對照；相同比例nZVI處理,有GO處理要低于無GO處理,但差異不顯著。單獨添加3%、5% nZVI以及GO+5% nZVI處理,SOD活性顯著升高,在5% nZVI處理組達到最大,較對照提高14%；共同添加GO和1%、3% nZVI處理,SOD活性分別低于單獨添加1%、3% nZVI處理,差異顯著。添加鈍化劑處理CAT活性顯著降低,并隨nZVI添加比例的增加而下降,GO+5% nZVI處理最低,較對照降低了59%。單獨添加GO的處理,CAT活性較對照降低了52%；共同添加GO和nZVI較單獨添加nZVI 處理,CAT活性顯著降低,在GO+5% nZVI處理降低最多,達到了42%。

與對照相比,添加鈍化劑處理MDA含量顯著降低,GO+3% nZVI處理為最低,降低了48%；單獨添加GO處理比對照減少29%；共同添加GO和3%、5% nZVI處理較單獨添加3%、5% nZVI處理,MDA含量顯著降低。

圖1 鈍化劑對高羊茅保護酶活性和MDA含量的影響Fig.1 Effects of passivators on protective enzyme activity and MDA content ofFestuca arundinaceaCK：對照,control；N1：1%納米鐵,1% nanoscale iron；N3：3%納米鐵,3% nanoscale iron；N5：5%納米鐵,5% nanoscale iron；G：1%氧化石墨烯,1% graphene oxide；GN1：1%氧化石墨烯+1%納米鐵,1% graphene oxide+1% nanoscale iron；GN3：1%氧化石墨烯+3%納米鐵,1% graphene oxide+3% nanoscale iron；GN5：1%氧化石墨烯和5%納米鐵,1% graphene oxide+5% nanoscale iron；圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=4)

2.4 鈍化劑對高羊茅地上部重金屬含量的影響

如表3所示,除單獨添加1% nZVI處理外,鈍化劑均顯著降低了高羊茅地上部Cu和Pb含量,且添加GO后降低的更多。對于Cd、Zn而言,共同添加GO和nZVI處理,其含量均顯著低于對照；單獨添加nZVI處理和對照差異不顯著。除單獨添加1%和3% nZVI處理外,其他鈍化劑處理,Cr含量均顯著低于對照。與單獨添加nZVI相比,共同添加GO與nZVI,顯著降低Cu、Cd、Pb、Cr含量。

3 討論與結論

種子萌發是植物生長的初始階段,它可以對外界生長環境做出敏感反應,因此種子萌發試驗被廣泛用于評價堆肥質量研究中[18]。研究發現,堆肥中添加GO能顯著促進高羊茅種子的萌發。Khodakovskaya等[19]研究發現,碳納米材料處理能顯著促進番茄種子萌發,認為碳納米材料能夠穿透厚的種皮,促進種子對水分的吸收,從而促進番茄種子的萌發和幼苗的生長。吳金海等[20]研究發現,5 mg/L GO處理能顯著提高油菜種子的發芽勢。這些研究表明,一定濃度的氧化石墨烯,會對種子萌發起促進作用,與本文研究結果一致。

表3 鈍化劑處理對高羊茅地上部重金屬含量的影響

葉綠素是與植物光合作用最密切相關的一種色素,其含量的高低可以衡量植物光合能力的強弱。試驗結果表明,單獨添加nZVI與共同添加GO和3%、5% nZVI能顯著增加高羊茅葉綠素含量,促進其光合作用,這與對植物地上生長影響相一致。王靜等[21]研究發現,增加供鐵可顯著提高油松幼苗的光合能力；龍文靖等[22]研究發現,玉米苗期葉綠素含量隨供鐵濃度增加而增加。由于nZVI具有強的還原性,它能被氧化釋放出二價和三價的鐵離子[13],從而提高了堆肥中可供植物吸收的鐵元素含量,進而導致光合作用增強。而由nZVI氧化產生的鐵離子是否會引起毒性效應,還有待于進一步研究；但也有報道,10%的nZVI經過老化后,并未對土壤及其微生物產生不良影響[23]。另外,納米材料本身也能通過抑制氧化脅迫來提高逆境條件下植物的光合能力[24]。研究發現,3%、5% nZVI處理及聯合GO,生物量顯著增加。有研究顯示,碳納米材料能促進根的伸長和植物生物量的積累[25],這與本研究的結果一致。植物體內的重金屬含量也表明,添加GO和nZVI能降低植物對堆肥重金屬的吸收,說明GO和nZVI能對堆肥重金屬起到吸附鈍化作用,從而減輕了重金屬對植物的脅迫,促進了生物量的積累。

正常生長條件下,植物細胞產生的活性氧與本身的抗氧化防御系統處于動態平衡狀態。植物在脅迫環境下,體內活性氧增加,過量的活性氧會導致生物大分子的氧化,植物抗氧化防御系統通過提高抗氧化酶活性來減小活性氧的傷害。通過MDA含量來反映脂質過氧化水平,保護酶活性可以用來判斷植物受脅迫程度,SOD可以催化超氧自由基生成H2O2,而H2O2可以被POD和CAT所清除[26]。本研究結果表明,添加3%、5% nZVI的處理,POD和SOD的活性升高, MDA含量均下降,說明nZVI處理提高了抗氧化酶活性,清除活性氧的能力增強,從而減輕了膜質過氧化。Li和Huang[27]的研究發現,納米羥基磷灰石(nHAP)能誘導Cd脅迫下小白菜抗氧化酶活性,抑制了植物對Cd的吸收,降低MDA含量,說明nHAP降低了污染土壤中Cd的生物有效性,增強了植物的抗Cd能力。本研究中,鈍化劑處理CAT活性降低,可能是在清除H2O2過程中導致的酶失活或酶合成受阻[28]。因此,在3%、5%nZVI處理中,高羊茅POD和SOD活性升高,MDA含量下降,可能是因為GO和nZVI鈍化了堆肥中重金屬,減少了植物對重金屬的吸收,減輕了植物所受脅迫的傷害。

綜上所述,堆肥基質中施入GO和nZVI,促進了高羊茅種子的萌發,且隨nZVI添加比例的增加而提高。3%、5% nZVI單獨添加以及和GO的共同添加,均提高了高羊茅葉綠素含量和地上生物量。3%、5%的nZVI提高了高羊茅SOD和POD活性,降低了MDA含量,減少了植物對堆肥重金屬的吸收。因此,nZVI和GO兩種材料能夠固定堆肥中的重金屬,減少植物對重金屬的吸收,對植物生長具有一定的促進作用。