腎盂尿液熒光原位雜交檢測在腎盂上皮細胞癌診斷中的價值

陸勇，何雪峰，平季根

(蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006)

腎盂惡性腫瘤占全部腎臟惡性腫瘤約7%～8%，其中90%為泌尿系統上皮來源。臨床上，腎盂腫瘤的診斷主要依靠尿脫落細胞學和影像學檢查，但是這些檢查方法往往會延誤腎盂腫瘤的早期診斷[1,2]。研究證實，對尿液進行熒光原位雜交(FISH)檢測診斷膀胱上皮細胞癌的敏感性明顯優于脫落細胞學，特異性與脫落細胞學檢查相當[3～5]。近期研究發現，對尿液進行FISH檢測診斷上尿路上皮細胞癌同樣具有較高的敏感性和特異性；但是，由于尿液取材通常為晨尿，常存在尿液標本中細胞收集數量不足等因素，使FISH檢測對于早期上尿路上皮腫瘤的診斷率仍不是十分理想[6～8]。因此，本研究采用經膀胱鏡下輸尿管置管后收集腎盂尿液進行FISH檢測，并與常規收集晨尿標本檢測的結果進行比較，評估經膀胱鏡下輸尿管置管后收集腎盂尿液行FISH檢測對腎盂上皮細胞癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年10月～2016年12月在我院疑診為腎盂占位的患者44例，男30例、女14例，年齡(67.0±1.2)歲。均行泌尿系統CT、逆行上尿路造影以及膀胱鏡檢查，排除膀胱腫瘤和輸尿管腫瘤可能。排除腎功能不全以及泌尿系統感染的患者。患者均行活體組織病理快速檢查，以組織病理學診斷作為確診腎盂上皮細胞癌的金標準。同期，收集20名健康志愿者的晨尿行FISH檢測，以建立正常人群的閾值。本研究經過醫院倫理委員會批準并告知患者及志愿者，簽署知情同意書。

1.2 尿液取材方法 所有患者在行膀胱鏡檢查前、健康志愿者在清晨，留取晨尿100 mL。然后對疑診腎盂占位患者局麻，膀胱鏡下從患側輸尿管開口插入F5輸尿管導管至腎盂，留置F5輸尿管導管，收集腎盂尿液共100 mL。所有尿液樣本均在2 h內送檢行FISH檢測。

1.3 FISH檢測方法 收集尿液中的細胞進行樣本玻片制備及預處理，尿液標本置于兩個50 mL離心管中經5次離心，去上清。離心過程中，依次加入膠原酶B(0.005 g/5 mL Hank′s BSS)，KCL低滲溶液，固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)，吹打懸浮細胞，將細胞滴于玻片上，56 ℃環境中老化玻片。RNaseA溶液處理完畢后，立即將玻片置于37 ℃胃蛋白酶溶液中，室溫下于2×SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片2次。將玻片依次置于-20 ℃預冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，自然干燥玻片。將標本、探針混合物置于(73±1)℃水浴箱中變性。玻片經梯度脫水，自然干燥后，與探針雜交。將10 μL變性后的探針混合物滴于玻片雜交區域，置于預熱的濕盒中，42 ℃保溫箱中過夜雜交。玻片經洗滌后，置暗處自然干燥。將15 μL DAPI復染劑滴加于雜交區域位置，在熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組觀察玻片。

1.4 FISH結果分析與判定 所用的FISH探針包括兩種組合，CSP3/CSP7和GLP P16/CSP17探針，探針位點分別為3p11.1-q11.1/7p11.1-q11.1和9p21/17p11.1-q11.1，正常情況熒光顯微鏡下均可見2紅與2綠兩種顏色信號。異常信號主要表現為：3、7、17號染色體主要表現為非整倍體擴增，即細胞核內出現多于2個信號的表現；p16位點表現為缺失，即細胞核內出現少于2個信號。觀察正常人的100個不重疊的細胞核，計數3、7、17號染色體非整倍體改變數值和p16位點缺失的細胞數，并計算出異常細胞數所占百分比，根據公式[閾值=平均值(M)+3×標準差(SD)]計算出正常人的閾值。異常結果以100個細胞核內出現3、7、17號染色體非整倍體改變和p16位點缺失的細胞百分比大于閾值為標準，且出現2種及以上探針信號異常時可診斷為腎盂上皮細胞癌。計數由兩名專業人員獨立完成，結果一致方可認定，主要分析細胞核大、不典型、不規則的細胞。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。組間比較采用配對資料的χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理檢查結果 經病理檢查確診腎盂上皮細胞癌35例，均行根治性腎輸尿管全切術。術后病理結果示Tis期2例、Ta期15例、T1期13例、T2期5例；低級別尿路上皮癌26例，高級別尿路上皮癌9例；腫瘤直徑0.8～2.2(1.7±0.2)cm。術后標本解剖發現，腫瘤大多體積較小，呈現乳頭樣或息肉樣外觀。腎臟或腎盂良性病變9例，包括腎盂炎性病變3例、腎盂血塊(血塊伴機化)1例、腎盂結石或鈣化4例、腎盂輸尿管淀粉樣變性1例。見圖1。

注：a為CT所見腎盂可疑占位(箭頭所示)，增強信號不明顯；b為靜脈腎盂造影，右側腎盂腎盞未見充盈缺損；c為術后腎盂腫瘤組織標本，呈息肉樣外觀(箭頭所示)。

2.2 正常人尿液FISH檢測結果 20例正常人的尿液FISH檢測結果對應的3、7、17號染色體非整倍體改變和p16位點缺失的正常閾值分別為3.9%、2.1%、2.4%和1.2%。

2.3 疑診腎盂占位患者的尿液FISH檢測結果 對患者晨尿、腎盂尿液檢測后，診斷腎盂上皮細胞癌分別為24、32例。

2.4 晨尿、腎盂尿液FISH檢測對腎盂上皮細胞癌的診斷價值比較 晨尿FISH檢測診斷腎盂上皮細胞癌的敏感性為68.6%(24/35)、特異性為77.8%(7/9)；腎盂尿液FISH檢測診斷腎盂上皮細胞癌的敏感性為91.4%(32/35)、特異性為77.8%(7/9)，經膀胱鏡輸尿管導管收集腎盂尿液FISH檢測診斷腎盂上皮癌的敏感性高于晨尿(χ2=4.6，P<0.05)。

2.5 假陽性分析 9例腎盂或腎臟良性病變患者中，出現FISH檢測假陽性2例，其中1例為腎盂輸尿管淀粉樣變性、1例為泌尿系統炎癥，均體現在3、7、17號染色體的非整倍體擴增，而未出現p16位點的缺失。9例患者經5～36個月的嚴密隨訪，未發現患泌尿系上皮腫瘤的證據。

3 討論

腎盂上皮細胞癌是一種臨床上較少見的疾病，僅占泌尿系統上皮腫瘤的5%[9]。目前，對于腎盂腫瘤的診斷主要依靠CT、靜脈/逆行腎盂造影、脫落細胞學和輸尿管鏡檢查。然而，對于體積較小的腎盂腫瘤，CT增強信號可能不明顯，腎盂造影又無充盈缺損改變，影像學資料難以明確診斷，往往延誤了疾病的治療，導致腎盂腫瘤預后較差[1,10]。尿脫落細胞學檢查對上尿路腫瘤的診斷意義并不大，其檢出率只有37.5%～50.0%[11]。雖然通過輸尿管鏡檢查，可以提高上尿路腫瘤的診斷率，但輸尿管鏡是一種有創診斷方法，可能會造成腎盂輸尿管穿孔、出血、輸尿管撕脫等較嚴重的并發癥，并且發生在腎下盞的腫瘤，由于觀察角度受限，往往會被漏診，一些病變不明顯、無法準確取到組織進行活檢的病例也往往會被遺漏。因此，需要一種檢出率高、創傷性較小的方法來提高腎盂腫瘤的診斷率。

近年來，由于FISH具有較高的診斷敏感性和特異性，已被廣泛應用于膀胱上皮細胞癌的檢測。由于膀胱和腎盂上皮屬于同一組織來源，Zhang等[12]用高通量基因芯片技術研究了腎盂和膀胱上皮腫瘤的基因表達情況，發現這兩種腫瘤在遺傳背景上無明顯差別，僅在信號通路上存在CLCA2(1p22.3)和GABRE(Xq28)兩個基因位點的差異。這樣，應用FISH檢測上尿路上皮腫瘤就有了理論基礎。近期，國外一些小樣本量的研究發現，無創性留取尿液行FISH檢查診斷上尿路上皮癌的敏感性為75%～87.5%，特異性為80%～95%[6,7]。然而，Johannes等[8]應用FISH檢測67例上尿路腫瘤患者的尿液樣本時，發現FISH的診斷敏感性只有56%，認為FISH對于上尿路腫瘤的診斷有限，原因可能是尿液中腫瘤細胞過少所致，并認為采取有創方法收集尿液，有可能提高FISH診斷的敏感性。Lodde等[13]應用免疫細胞化學試驗檢測上尿路上皮腫瘤時，采取輸尿管置管留取尿液的方法，診斷敏感性從75%提高到91%。Mian等[14]對尿路上皮癌研究發現，通過輸尿管置管留取尿液的方法，可以降低由于泌尿系統良性病變導致的診斷假陽性率。我們考慮由于膀胱尿液中的腫瘤細胞數量或濃度的不足，影響了FISH檢測結果，而且對懷疑腎盂上皮細胞癌的患者行膀胱鏡檢查是必須的，故采用膀胱鏡下輸尿管置管后留取腎盂尿液，行FISH檢測，可能成為腎盂上皮細胞癌診斷的一種較可靠并且創傷較小的方法。本研究率先在國內采用膀胱鏡下輸尿管導管置入后收集腎盂尿液，應用FISH檢測了44例疑診腎盂尿路上皮細胞癌患者的尿液樣本，結果發現，對腎盂尿液進行FISH檢測診斷腎盂上皮細胞癌的敏感性為91.4%，明顯高于常規晨尿檢測所得結果(68.6%)，表明通過輸尿管置管留取腎盂尿液的方法，可以提高FISH檢測腎盂上皮細胞癌的診斷敏感性。

對腎盂腫瘤的早期診斷和早期治療是提高腎盂癌預后的關鍵，因而提高早期、低級別腎盂腫瘤診斷的準確性顯得十分重要。本研究中，35例腎盂上皮細胞癌有30例為非肌層浸潤性上皮癌，26例病理為低級別，這些腎盂腫瘤患者的影像學檢查很難明確是否為腎盂尿路上皮癌，主要因為CT檢查發現腎盂占位較小，病變組織增強信號不明顯，而且靜脈/逆行腎盂造影無明顯充盈缺損，而輸尿管留取尿液行FISH檢測則診斷出32例、敏感性為91.4%，表明采用輸尿管留取尿液行FISH檢測，對早期腎盂上皮細胞癌的診斷具有較高的敏感性。

目前，對于FISH檢測出現假陽性結果的研究較少，有學者認為，一些泌尿系統良性疾病包括結石、炎癥等確實存在FISH假陽性結果，主要原因可能是有活性的淺表傘狀細胞和精囊腺細胞出現多倍體擴增以及試劑廠家制定的標準閾值偏低有關，并認為根據細胞形態和患者病史綜合考慮，可以降低FISH結果的假陽性率[15]。本研究中，FISH檢測出現2例相同的假陽性結果，1例為腎盂輸尿管淀粉樣變性、1例為泌尿系統炎癥，主要原因可能是根據正常人設定的閾值偏低所致，表明輸尿管留取尿液行FISH檢測并不能提高其檢測的特異性，通過擴大泌尿系統良性疾病樣本量，重新設定閾值，有望提高FISH檢測的特異性。

綜上，應用膀胱鏡下輸尿管置管獲取腎盂尿液的方法，能顯著提高FISH檢測腎盂上皮細胞癌的敏感性，有可能成為早期診斷腎盂上皮細胞腫瘤的一種創傷較小的可靠方法。