大鼠肝癌細胞Mael、Ddx4 mRNA及蛋白的表達及意義

古麗米熱·依米提，王延蛟，斯坎德爾·白克力

(新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊830011)

肝癌是世界上第5大常見惡性腫瘤，在我國排在惡性腫瘤第2位[1]。研究發現，Piwi-interacting RNA與Piwi蛋白相作用的RNA(piRNAs)在肝癌中異常表達，并在肝癌的發生發展中發揮重要作用[2]。Piwi/piRNAs通路基因蛋白質漩渦同系物基因(Mael)和生殖細胞特異性蛋白4(Ddx4)為候選癌基因，在多種惡性腫瘤細胞系中都有表達[3]。研究發現，Mael基因在乳腺癌細胞及乳腺癌組織中都存在高表達[4]。Ddx4是一種腫瘤干細胞標志物，也是細胞質蛋白、干細胞蛋白、生殖細胞特異性標志物，Ddx4的高表達與卵巢癌的發生有關[5]。近年研究發現，Piwi/piRNAs可能與肝癌的增殖、抗凋亡以及侵襲轉移等發生發展密切相關[6]。2017～2018年，我們檢測了大鼠肝癌CBRH-7919細胞中Mael和Ddx4基因mRNA轉錄及蛋白表達水平的變化，探討Mael和Ddx4基因的表達水平在肝癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 大鼠肝癌CBRH-7919細胞、正常肝細胞BRL由中科院上海細胞庫提供。RPMI1640液體培養基和胎牛血清、DEN(純度99.9%)購自美國Sigma公司；Mael、Ddx4和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mael、Ddx4和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體購自Abcam公司；加強型組織/細胞RNA快速提取試劑盒購自聚合美生物公司；RNeasy Mini試劑盒、RT-PCR試劑盒均為Qiagen公司；蛋白裂解液購自美國Thermo公司；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司根據設計合成。

1.2 細胞分組及培養 將大鼠肝癌細胞CBRH-7919作為肝癌細胞組，正常肝細胞BRL作為正常肝細胞組，均在無菌條件下加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，細胞在37 ℃、5%CO2的孵箱內進行培養。每次換液之前加入PBS，兩次沖洗細胞，再用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液換液，均取對數期細胞進行檢測。

1.3 Mael、Ddx4 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。兩組細胞培養至對數期后，用TRIzol法提取細胞進行總RNA提取。取質量符合要求的RNA產物，逆轉錄得到cDNA。按SYBR Green Real-time PCR(TaKaRa) 試劑盒的操作步驟進行實時熒光定量qRT-PCR。Mael引物上游5′-GAGGATTTCGGTTCCATTGCC-3′，下游5′-TTTCTGATGCCCGCTCCATAC-3′，擴增片段189 bp；Ddx4引物上游5′-ACAGGATGTTCCTGCGTGG-3′，下游5′-TGTTCAGTGTGTTCTTGCCCT-3′，擴增片段192 bp；GAPDH引物上游5′-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3′，下游5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3，擴增片段171 bp。反應體系：25 μL反應體系含1 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.6 μL上游引物、1.6 μL下游引物、10.3 μL dd H2O。PCR反應條件為：95 ℃起始變性3 min，隨后95 ℃變性10 s，退火30 s(GAPDH退火溫度60 ℃，Mael退火溫度60 ℃，Ddx4退火溫度58 ℃)共40個循環，延伸65～95 ℃ 10 s，40個循環。結果用2-ΔΔCt計算。

1.4 Mael、Ddx4蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將兩組細胞加入1 mL裂解液，裂解20 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液；吸取加入200 μL BCA液，37 ℃水浴30 min，酶標儀測定562 nm處吸光值，根據標準曲線計算出蛋白濃度；取10 μg用以檢測Mael、Ddx4以及內參GAPDH等蛋白質，一抗為兔抗鼠多克隆抗體(GAPDH按1∶1 000；Mael按1∶2 000；Ddx4按1∶500)，SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜五次，HRP標記的(山羊抗兔1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜五次，加入ECL化學發光試劑進行曝光。

2 結果

2.1 兩組Mael、Ddx4 mRNA表達比較 肝癌細胞組Mael、Ddx4 mRNA表達均高于正常肝細胞組(P均<0.01)。見表1。

2.2 兩組Mael、Ddx4蛋白表達比較 肝癌細胞組Mael、Ddx4蛋白表達均高于正常肝細胞組(P均<0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表達比較

注：與正常肝細胞組相比，*P<0.01。

注：1為肝癌細胞組，2為正常肝細胞組。

3 討論

肝癌是最常見的腫瘤之一，肝癌的病死率與發病率在惡性腫瘤中均較高[7]。肝癌發生發展是多因素協同的復雜過程[8]。目前，對癌癥發生發展的研究主要集中在細胞信號轉導、腫瘤相關基因的調控方面[9]。piRNAs在肝癌中異常表達，并在肝癌的發生發展中發揮重要作用。piRNAs的失調能夠通過影響細胞的生長、凋亡遷移和侵襲等生物學過程，影響肝癌的發生和進展[10]。piRNAs在癌細胞中表達異常，與腫瘤的發生及擴散、疾病的預后等密切相關[11]。

Piwi/piRNA通路基因Mael和Ddx4為候選癌基因，在多種惡性腫瘤細胞系中都有表達[12]。Mael基因是癌基因，也是睪丸生殖細胞特異表達基因，在肺癌細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞和前列腺癌細胞中都有不同程度的表達[13]。研究發現，Mael在多種腫瘤細胞系中都有表達，在乳腺癌和肺癌中相對其他腫瘤細胞系高表達[14]。Ddx4是一種較為熟知的腫瘤干細胞標志物，研究發現Ddx4的高表達與卵巢癌的發生、發展密切相關[15]。本研究發現，肝癌細胞組Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表達均高于正常肝細胞組，表明大鼠肝癌細胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表達均明顯增高，可能在肝癌發生及發展具有重要作用，可作為肝癌的一項新的分子標志物。

綜上所述，大鼠肝癌細胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表達均明顯增高，Mael和Ddx4基因表達與肝癌發生發展有一定的關系。肝癌細胞中Mael和Ddx4基因表達水平變化有可能作為肝癌的檢測及治療的一種分子標志物。