糖尿病腎病小鼠腎組織與細胞中miR-92b表達及其對纖維化的影響

申永超，蔡勝艷，董天，龐晨，楊偉振

(牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江牡丹江157011)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一。近年研究表明，微小RNA(microRNA,以下簡稱miRNA)與DN腎纖維化密切相關，如可促進纖維鏈接蛋白(FN)的表達[1,2]，但具體的miRNA仍不能完全被識別。有文獻報道，miR-92b可通過磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路調節神經膠質瘤細胞和非小細胞肺癌細胞的增殖和凋亡[3]。而PI3K/Akt信號通路又是DN病變過程中一條重要的轉導路徑，調控著DN時的腎小管間質纖維化[4]。FN作為間質細胞的標志蛋白之一，在腎小管間質纖維過程中起著重要作用。目前，miR-92b是否通過PI3K/Akt信號通路調控FN的表達變化從而參與DN腎纖維化過程，尚未見文獻報道。2017年6月～2018年5月，我們對DN小鼠及人腎小管上皮細胞中miR-92b的表達變化進行觀察，并探討其對FN的影響與機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 8周齡C57BL/6雄性小鼠12只，體質量20～25 g，購自上海斯萊克動物公司。腎小管上皮細胞株HK-2購自中國科學院上海細胞庫；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；SYBR Green Master購自Roche公司；TRIzol和Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；RPMI-1640細胞培養基購自Hyclone公司；胎牛血清及減血清培養基購自廣州翔博生物技術有限技術公司；miR-92b引物、miR-92b mimics及miRNEG對照購自廣州銳博生物科技有限公司；Taq酶、抗β-actin抗體、抗FN抗體、兔抗大鼠Akt、兔抗大鼠p-Akt單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcom公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自KaTaRa公司；BCA試劑盒購自Thermo公司；CO2培養箱(Thermo公司)；RT-PCR擴增儀(Bio-Rad公司)；三諾安穩血糖儀(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；9.4 T高磁場磁共振小動物成像儀(BruKer公司)。

1.2 DN小鼠腎組織miR-92b、PI3K/Akt信號通路相關蛋白及FN表達檢測

1.2.1 DN模型制備 選取8周齡C57BL/6雄性小鼠12只，隨機分為DN模型組(Dia組)和對照組(Con組)，每組6只，Dia組按70 mg/kg左下腹腔內一次性注射STZ溶液(臨用前用 pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)，分3次隔日注射；對照組注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，分3次隔日注射。8周后，連續3 d小鼠尾靜脈采血測定隨機血糖，Dia組小鼠血糖≥16.70 mmol/L，表明糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立5個月后，Dia組小鼠體質量明顯降低，血糖和腎指數顯著升高，尿液微量白蛋白(MAU)和尿N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖甙(NAG)含量顯著升高；行高磁場磁共振腎臟檢查示腎臟T2WI壓脂信號減低，腎皮質與髓質變薄、交界不清，腎盂變小(見圖1)，表明腎臟發生病變，DN模型制備成功。

注：A為Con組；B為Dia組。

1.2.2 DN小鼠腎組織miR-92b表達檢測 采用RT-PCR法。造模5個月時處死兩組小鼠，提取腎組織RNA，檢測RNA濃度及純度，并將RNA合成cDNA。配制20 μL的RT- PCR混合反應體系：cDNA 2 μL，RT引物各0.8 μL，SYBR Green Mix熒光染料6.4 μL，無菌蒸餾水10 μL。反應條件為50 ℃升溫2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；擴增至40個循環，以U6為內參。

1.2.3 DN小鼠腎組織PI3K/Akt信號通路相關蛋白及FN蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白Akt、p-Akt和FN蛋白表達。小鼠腎組織蛋白質被RIPA裂解液裂解后，離心5 min，取上清至0.5 mL離心管中。蛋白濃度測定按照BCA試劑盒說明書進行，并進行蛋白樣品處理。配置10%的SDS-PAGE，將上述150 μg蛋白質SDS-PAGE電泳，轉膜，BSA封閉，加入一抗過夜，二抗室溫孵育，洗膜。以β-Actin為內參,用ECL化學發光法檢測目的蛋白的表達。

1.3 DN細胞miR-92b、PI3K/AKT信號通路相關蛋白及FN表達檢測

1.3.1 細胞培養 人腎小管上皮細胞株HK-2正常傳代，并維持在RPMI-1640培養基中(含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg /mL)，置于條件為飽和濕度、5%CO2、37 ℃的培養箱中培養。每3天用0.5%胰蛋白酶消化傳代，待細胞長至培養瓶80%后分為3 組，每組4瓶，并以無血清培養基饑餓24 h。

1.3.2 高糖對細胞miR-92b表達影響的觀察 HK-2細胞接種于培養瓶中，每組4瓶。高糖組(HG組)用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h；低糖組(LG組)用5 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h；高滲對照組(DG組)用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激24 h，以作為高滲對照。24 h后收集細胞，冷藏于-80 ℃冰箱，采用RT-PCR法檢測miR-92b表達，方法同1.2.2。

1.3.3 轉染miR-92b對PI3K/Akt信號通路相關蛋白及FN表達影響的觀察 將HK-2細胞隨機分為DG組、HG組、HG+miR-92b mimics組(HG+miR-92b組)和HG+miRNEG組(HG+Neg組)。DG組用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激24 h，HG組、HG+miR-92b組和HG+Neg組用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h。然后采用細胞瞬時轉染技術，按照Lipofectamine 2000說明書，將miR-92b轉染至HG+miR-92b組細胞中，將miRNEG對照轉染至HG+Neg組細胞中，轉染濃度為50 nmol/L。HG組、DG組不轉染。轉染24 h后收集細胞，采用Western blotting法檢測Akt、p-Akt和FN蛋白表達，實驗方法同1.2.3。

2 結果

2.1 各組小鼠腎組織miR-92b、p-Akt、Akt、FN蛋白表達比較 Con組、Dia組腎組織miR-92b蛋白表達量分別為0.035 37±0.005 51、0.021 30±0.002 92。與Con組相比，Dia組腎組織miR-92b表達量降低，p-Akt/Akt、FN/β-actin相對蛋白表達量升高(P<0.05)。見圖2。

注：A為Western blotting法檢測條帶；B為p-Akt/Akt相對蛋白表達量；C為FN/β-actin的相對蛋白表達量。 *為與Con組比較，P<0.05。

2.2 各組細胞miR-92b、p-Akt、Akt、FN蛋白表達比較 LG組、HG組、DG組miR-92b蛋白表達分別為1.134 0±0.045 9、0.524 7±0.018 7、1.299 0±0.045 9，HG組細胞miR-92b表達低于LG組(P<0.001)。p-Akt/Akt、FN/β-actin相對蛋白表達量均升高(P均<0.05)。見圖3。

注：A為Western blotting法檢測條帶；B為p-Akt/Akt相對蛋白表達量；C為FN/β-actin的相對蛋白表達量。 *為與Con組比較，P<0.05。

2.3 轉染miR-92b對PI3K/AKT信號通路相關蛋白及FN表達的影響 與DG組相比，HG組p-Akt/Akt、FN/β-actin相對蛋白表達量升高；與HG組相比，HG+92b組p-Akt/Akt、FN/β-actin相對蛋白表達量均降低(P<0.001)。見圖4。

3 討論

注：A為Western blotting法檢測條帶；B為p-Akt/Akt相對蛋白表達量；C為FN/β-actin的相對蛋白表達量。 *為與HG組比較，P<0.05。

DN病因機制繁多，隨著病情的發展，DN將導致慢性腎功能衰竭，引起終末期腎病。目前DN已是導致1型和2型糖尿病慢性腎功能衰竭的主要原因，約30%的糖尿病患者會患該并發癥。目前，對于DN的病因和發病機制仍舊不清。miRNA是一類內源基因編碼的長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區結合，抑制靶基因mRNA的翻譯或促進mRNA的降解，從而快速和靈敏地參與基因的表達調控，發揮其生物學效應，在生長發育、細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發生等過程中起著重要作用[5～7]。

目前，miRNA已成為研究DN的熱點，隨著對DN的分子致病機制深入研究，臨床基因治療DN的可能性越來越大，miR-92b或可能成為DN的診斷標志物和治療靶點。大量與DN相關的miRNA也已經被發現，例如miR-215、miR-25、miR-377等。miR-92b是一種與腫瘤細胞轉移和浸潤相關的miRNA，在多種腫瘤中表達異常，如鼻咽癌、肝癌、骨肉瘤等[8～10]。同時，在炎癥反應中，miR-92b可以抑制腸道細菌肽誘導的炎癥反應[11]。但是，miR-92b在DN中的作用仍未見有報道。本研究發現，Dia組小鼠腎組織miR-92b 表達低于Con組，表明DN時miRNA-92b表達水平降低，miRNA-92b可能在DN致病過程發揮著重要調控作用；DN細胞體外實驗結果示，HG組細胞中miR-92b的表達也低于LG組，進一步驗證了這一觀點。

PI3K/Akt信號通路在真核生物中廣泛表達，在細胞生長、分化、增殖和生存中起重要作用。Li等[3]研究表明，miR-92b可通過PI3K/Akt信號通路調節神經膠質瘤細胞和非小細胞肺癌細胞的增殖和凋亡。而機體高血糖時部分miRNA也會激活PI3K/Akt信號通路，并在DN發生和發展過程中起著重要作用[12]。本研究結果顯示，Dia組腎組織p-Akt/Akt相對蛋白表達量高于Con組，HG組細胞中p-Akt/Akt相對蛋白表達量也高于對照組LG組，提示DN時p-Akt表達水平升高。Akt作為PI3K的下游效應分子，p-Akt表達水平升高，表明DN時PI3K/Akt信號通路被激活。過表達miR-92b時，與HG組相比，，HG+92b組p-Akt/Akt相對蛋白表達量降低，即p-Akt表達水平降低，表明過表達miR-92b可顯著抑制PI3K/Akt信號通路，miR-92b可通過PI3K/Akt信號通路對DN的發生和發展起調控作用。

腎間質纖維化是DN病變過程中的重要事件，主要表現為腎小管上皮細胞丟失和細胞外基質堆積，此病變過程中腎小管上皮細胞向間質細胞轉化(EMT)起主導作用。FN作為間質細胞標志蛋白在腎小管EMT過程中起著重要作用。被激活的PI3K/Akt信號通路可通過上調FN基因的表達，導致FN在腎小管過度積累，從而促進腎小管EMT過程，加重DN時的腎纖維[13～15]。本研究發現，與Con組相比，Dia組小鼠腎組織中FN/β-actin相對蛋白表達量顯著升高，說明DN時FN mRNA表達水平也升高，我們同樣也在細胞實驗中驗證了這一觀點，與LG組相比，HG組細胞中FN mRNA表達水平升高；過表達miR-92b時，與HG組相比，HG+92b組FN/β-actin相對蛋白表達量顯著降低，說明miR-92b的過表達不僅可以抑制PI3K/Akt信號通路，也可以抑制FN mRNA的表達，因此考慮miR-92b可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制FN mRNA的表達。

綜上所述，DN小鼠及細胞中miR-92b表達水平降低，PI3K/Akt信號通路被激活和FN mRNA表達水平升高，過表達miR-92b可抑制PI3K/Akt信號通路、降低FN mRNA表達，從而減輕DN纖維化。本研究僅在動物及細胞水平對miR-92b在DN中的作用機制進行了初步探索，對于miR-92b抑制DN纖維的具體機制還需進一步研究。