白藜蘆醇對糖尿病腎病小鼠腎臟氧化應激及腎組織Nrf2通路蛋白表達的影響

高絲娜，李英，遲雁青，劉翠紅，曹義甫

(1石家莊市第三醫院，石家莊050000；2河北醫科大學第三醫院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的微血管并發癥。近年來，DN的發病率呈逐年上升的趨勢，已成為終末期腎衰竭的主要原因之一。因此，明確DN的發病機制及有效的防治措施是當前備受關注的研究熱點。大量研究表明，氧化應激是DN的主要病理生理機制。核轉錄因子(NF)E2相關因子2(Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，是細胞抗氧化還原的中樞調節者，Nrf2通過與抗氧化反應元件(ARE)相互作用，即Nrf2/ARE通路在細胞的防御保護中發揮重要作用[1]。血紅素氧合酶1(HO-1)是受Nrf2調節的比較重要的一種抗氧化酶。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素，近年研究表明，白藜蘆醇可能通過抑制氧化應激發揮對DN的保護作用。2018年，本研究旨在研究白藜蘆醇是否通過激活Nrf2通路來抑制DN的氧化應激損傷，我們觀察了白藜蘆醇對DN小鼠腎臟氧化應激反應及Nrf2通路蛋白表達的影響，探討白藜蘆醇對DN小鼠腎臟的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性CD-1小鼠100只，體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司(S0130)；白藜蘆醇購自Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗體及兔抗HO-1多克隆抗體購自Abcam公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及DN模型制備 采用單腎切除后STZ干預制備DN模型。將小鼠采用6%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔麻醉后行右腎切除術，2周后切口完全愈合。將小鼠隨機分為正常對照組、白藜蘆醇對照組、模型組、白藜蘆醇治療組4組，每組10只。模型組及白藜蘆醇治療組小鼠按140 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol枸櫞酸緩沖液中，pH為4.5)，72 h后尾尖取血測定血糖，以血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型成功的標志。正常對照組與白藜蘆醇對照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。

1.3 干預方法 DN造模成功后，將白藜蘆醇溶于0.5%羧甲基纖維素制成混懸液，白藜蘆醇對照組與白藜蘆醇治療組給予白藜蘆醇5 mg/(kg·d)灌胃，正常對照組與模型組給予相同體積的羧甲基纖維素溶液灌胃，共干預8周。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.4 腎功能相關指標檢測 造模成功后第8周，各組取6只小鼠，收集24 h尿液。股動脈取血，分離血清，用Olympus AU5400型自動生化分析儀檢測腎功能相關指標，包括24 h尿蛋白定量(UP)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.5 腎組織氧化應激指標檢測 取10%腎皮質勻漿100 μL，根據試劑說明書，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。取1%腎組織勻漿30 μL，采用黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD活性。

1.6 腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達檢測

1.6.1 免疫組化染色法檢測 切取腎臟，取部分腎組織置于4%多聚甲醛固定，切片厚4 μm，常規脫蠟至水，高壓修復，用SP三步法。一抗為兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶200稀釋)，兔抗HO-1多克隆抗體(1∶100稀釋)，用PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.6.2 Western blotting法檢測 取部分腎皮質組織，提取總蛋白及核蛋白，Bradford法進行蛋白定量?？偟鞍咨蠘恿繛?00 μg，核蛋白上樣量為50 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗封閉，Nrf2(1∶1 000)；HO-1(1∶2 000)，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h，再次洗膜后ECL發光顯影。以β-actin作為內參照，核蛋白以Histon-H1作為內參照。Western印跡條帶信號強度應用Image J2X軟件進行定量分析，測定各條帶的灰度值。

2 結果

2.1 各組腎功能相關指標比較 與正常對照組比較，模型組UP、Scr、BUN均升高；與模型組比較，白藜蘆醇治療組UP、Scr、BUN均下降(P<0.01或0.05)。見表1。

表1 各組腎功能相關指標比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組腎組織氧化應激指標比較 與正常對照組比較，模型組腎組織MDA含量增加、T-SOD活性降低(P均<0.01)；與模型組比較，白藜蘆醇治療組MDA含量降低、T-SOD活性升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎組織氧化應激指標比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 腎組織Nrf2及HO-1蛋白表達比較 ①免疫組化染色結果：Nrf2蛋白表達定位于腎小球固有細胞及腎小管上皮細胞的細胞質和細胞核，呈棕黃色顆粒。在正常對照組及白藜蘆醇對照組僅見少量表達，腎小管表達更明顯。模型組Nrf2蛋白表達較正常對照組增強，白藜蘆醇治療組Nrf2蛋白表達較模型組進一步增加。HO-1蛋白主要定位于腎小球壁層上皮細胞和腎小管上皮細胞的細胞質中，模型組HO-1蛋白表達較正常對照組增強，白藜蘆醇治療組HO-1蛋白表達較模型組進一步增加。見圖1、2。②Western blotting結果：模型組腎組織Nrf2總蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表達均高于正常對照組，白藜蘆醇治療組Nrf2總蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表達均高于模型組(P均<0.01)。見圖3、4。

3 討論

越來越多的研究證明，氧化應激是糖尿病及其并發癥發生的一個重要機制。在氧化應激存在時，機體的抗氧化能力減弱，能清除活性氧簇(ROS)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)等的含量降低，導致ROS過度積聚。而過多的ROS能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化形成脂質過氧化產物如MDA，因此MDA可反映體內氧化應激水平，并間接反映組織細胞氧化損傷的程度[2]。本研究發現，與正常對照組比較，模型組UP、Scr、BUN均升高，腎組織勻漿MDA含量增加、T-SOD活性降低，提示DN小鼠腎組織損傷，且MDA含量升高及T-SOD活力下降，表明DN小鼠腎臟組織中存在明顯的氧化應激。

注：A為正常對照組，B為白藜蘆醇對照組，C為模型組，D為白藜蘆醇治療組。

注：A為正常對照組，B為白藜蘆醇對照組，C為模型組，D為白藜蘆醇治療組。

圖3 各組腎組織Nrf2及HO-1蛋白表達情況

注：與正常對照組比較，△P>0.05，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

當出現氧化應激損傷時，機體會形成一套復雜的氧化應激應答系統。研究發現，Nrf2和它的胞質接頭蛋白Keap1是細胞抗氧化應激的中樞調節者。Nrf2是外源性有毒物質和氧化應激的感受器，正常情況下，Nrf2和細胞骨架相關蛋白Keap1結合成二聚體的形式存在于細胞質中，當受到外界氧化應激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離并轉位進入細胞核，然后通過與抗氧化應激反應元件ARE相互作用，誘導編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達[3]，如γ-谷氨酸合成酶(γ-GCS)、苯醌還原酶(NQO1)、谷胱甘肽S2轉移酶(GST)、HO-1等[4]。Jiang等[5]研究發現，在DN患者的腎小球中存在氧化應激且Nrf2水平增高；動物研究證實，Nrf2-/-小鼠與Nrf2+/+小鼠相比可產生更多的ROS，且出現更為嚴重的DNA氧化損傷和腎臟損傷，表明Nrf2對STZ誘發的腎臟損害具有重要的保護作用。

Nrf2誘導的下游抗氧化酶HO-1是血紅素降解反應的限速酶，能催化血紅蛋白分子降解為等摩爾的膽綠素、CO和自由鐵，而這些降解產物能通過減少氧化應激損傷、阻止細胞凋亡、對炎性反應的調節等發揮細胞保護作用[6,7]。Lee等[8]研究表明，HO-1在糖尿病狀態下發揮重要的腎臟保護作用。另有研究發現，應用誘導劑氯化亞錫上調STZ誘導的糖尿病的自發性高血壓大鼠HO-1的表達后，降低了腎皮質的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性和尿中8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-OHdG)、硫代巴比妥酸反應物質的排泄[9]。這些結果表明，誘導HO-1的表達能減少腎臟的氧化應激反應。本研究發現，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達均高于正常對照組，提示機體在出現氧化應激損傷時激發自身防御反應，通過激活Nrf2通路增加HO-1的表達，進而發揮抗氧化應激作用。

白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素，隨著對白藜蘆醇研究的深入，發現其具有抗氧化、保肝、 抗過敏、抗腫瘤、調節血脂、神經保護等多種生物學作用[10]。其對心血管疾病和腎臟疾病均有保護作用。Chang等[11]研究發現，白藜蘆醇能降低DN時的血糖和血肌酐，減少氧化應激損傷，抑制促炎癥細胞因子并上調腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)水平，這些可能均參與了對DN早期的保護作用。Ungvari等[12]研究發現，白藜蘆醇可以激活冠狀動脈內皮細胞Nrf2的轉錄活性，上調其目標基因如NADPH、HO-1等的表達，同時改善了高糖引起的氧化應激損傷，當用siRNA抑制Nrf2的表達時，白藜蘆醇的保護作用是明顯減弱的，提示白藜蘆醇的保護作用很可能是通過激活Nrf2通路來實現的。本研究發現，白藜蘆醇治療組與模型組比較，MDA含量減少、T-SOD活性增加，同時Nrf2總蛋白與核蛋白及HO-1蛋白表達均增多，表明白藜蘆醇能減輕DN小鼠腎臟的氧化應激損傷，而且可能是通過激活Nrf2通路來實現的。

綜上所述，白藜蘆醇對DN小鼠的腎組織具有保護作用，其機制可能是通過激活Nrf2通路、上調其下游的HO-1蛋白的表達，從而減少腎組織氧化應激損傷，進而保護腎臟功能。本研究為白藜蘆醇應用于臨床、延緩DN的進展提供了理論依據。