急性濕疹大鼠皮膚屏障功能變化及機制

葛一漫，胡一梅，馬韜，張靈玲，雍江堰，張朝明

(1成都中醫藥大學附屬醫院，成都610075；2成都中醫藥大學)

人體皮膚直接與外界接觸，在一定程度上可以阻止外部環境中不利因素的侵害，還可防止體內水分的丟失。皮膚屏障主要指角質層結構相關的屏障，角質層結構主要包含角質細胞及細胞間脂質。任何改變角質層結構蛋白功能、脂質正常代謝的因素都可能會導致皮膚屏障功能異常。本課題組前期研究發現，急性濕疹的發病及病情的轉歸與皮膚屏障功能是否完好密不可分。但急性濕疹疾病中皮膚屏障的異常究竟是破壞了角質細胞結構，還是脂質結構，或者二者兼有尚需進一步證明。2016年1月～2018年12月，本實驗擬通過比較正常大鼠和急性濕疹大鼠皮膚病理改變，探討急性濕疹大鼠發病與皮膚屏障異常的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑與儀器 SD大鼠20只，體質量(200±20)g，由成都達碩動物實驗有限公司提供；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(成都科龍化工試劑廠)；AF200皮膚表皮水分喪失測定儀(英國BIOX公司)；一抗PAR-2(北京博奧森生物技術有限公司)；二抗及相應試劑盒及陽性片(北京中山金橋生物有限公司)；Image-Pro Plus圖像分析系統(Media Cybernetics公司)

1.2 動物分組及模型建立 采用隨機數字表法，將20只大鼠按分層隨機法分為正常組、模型組各10只。模型組大鼠腹部、右背部剃毛后，于腹部涂5% DNCB 30 μL進行首次致敏，第3、5、7天于右背部涂0.2% DNCB 50 μL進行抗原攻擊。第9天觀察大鼠造模區皮膚是否有急性濕疹癥狀，如皮膚上出現紅斑、水腫、丘疹、丘皰疹、水皰、糜爛等濕疹樣皮損表現，即為造模成功。

1.3 觀察指標

1.3.1 皮膚組織經皮水分丟失量(TEWL) 采用AF200皮膚表皮水分喪失測定儀測量大鼠造模區皮膚組織3次，取平均值作為TEWL。

1.3.2 皮膚病理改變 采用斷頸法處死大鼠，手術剪取兩組大鼠右背部皮膚，放入固定液中。石蠟包埋并切片，采用HE染色法觀察組織病理改變，并作病理損傷評分：0分為皮膚的表皮、真皮結構完好清楚，層次分明，未見變性、壞死、過度角化，未見棘層增厚，周圍組織未見水腫及炎細胞，細胞浸潤等病理性改變；1分為皮膚的表皮、真皮結構輕度破壞，層次稍不分明，偶見變性、壞死、輕度角化，偶見棘層增厚，周圍組織偶見水腫及炎細胞，細胞呈灶性浸潤等病理性改變；2分為皮膚的表皮、真皮結構中度破壞，層次不分明，可見變性、壞死、過度角化，可見棘層增厚，周圍組織可見水腫及炎細胞，細胞呈彌漫性浸潤等病理性改變；3分為皮膚的表皮、真皮結構重度破壞，層次不分明，明顯可見變性、壞死、過度角化，棘層增厚，周圍組織有水腫及炎細胞，細胞彌漫性浸潤等病理性改變。

1.3.3 人類中間絲聚合蛋白(FLG)mRNA表達 采用RT-PCR法檢測。用TRIzol法提取急性濕疹大鼠皮膚組織中的總RNA，并鑒定檢測樣本純度。FLG上游引物5′-CGAGGTGACCTGCACCAATGAC-3′，下游引物3′-CTGCTCCACCTTCGGGCCGACCCAC-5′，擴增長度186 bp；β-actin上游引物 5′-TCTAGGCACGTGGCAAGGTGTG-3′，下游引物 5′-TCATGAGGTAGTTGCCGTCAGG-3′，擴增長度125 bp。根據RT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應，使用System SDS Software軟件計算循環閾值(Ct)，采用β-actin作為內參照基因，以2-ΔΔCt作為FLG mRNA的表達水平。

1.3.4 蛋白酶激活受體2(PAR-2)表達 采用免疫組化染色法檢測。剪取大鼠右背部皮膚，放入固定液中，逐級乙醇固定，石蠟包埋并切片，采用免疫組化SP法檢測PAR-2表達，加入一抗PAR-2、二抗及陽性片。顯色復染封片，顯微鏡觀察。以細胞質呈棕黃色或黃色表達為陽性判斷標準，采用Image-Pro Plus圖像分析系統半定量檢測積分光密度(IOD)，表示PAR-2表達。

2 結果

2.1 兩組皮膚外觀比較 正常組皮膚光滑無異常，模型組右背部造模區皮膚出現肉眼可見糜爛、紅腫、丘疹等急性濕疹癥狀。

2.2 兩組皮膚組織TEWL比較 正常組、模型組皮膚TEWL分別為(2.35±0.18)、(11.36±1.66)g/(h·m2)，模型組TEWL高于正常組(P<0.01)。

2.3 兩組皮膚病理改變 正常組大鼠皮膚組織結構清晰完整，未見任何炎癥充血水腫病理性改變，見圖1、2。模型組大鼠呈急性濕疹病理改變，如皮膚組織結構模糊、水腫、充血及炎細胞浸潤等，見圖3、4。正常組、模型組病理評分分別為0、(2.20±0.63)分，模型組病理評分高于正常組(P<0.01)。

注：A為正常組，×100；B為正常組，×400；C為模型組，×100；D為模型組，×400。

2.4 兩組皮膚FLG mRNA比較 正常組、模型組FLG mRNA表達分別為6.2±0.68、0.79±0.19，模型組FLG mRNA表達低于正常組(P<0.01)。

2.5 兩組皮膚組織PAR-2蛋白表達比較 正常組中PAR-2陽性物質染色顏色淺，分布少見。模型組中PAR-2陽性物質染色深，分布廣泛。正常組、模型組PAR-2蛋白表達分別為0.153 4±0.002 2、0.170 8±0.011 5，模型組PAR-2蛋白表達高于正常組(P<0.01)。

3 討論

急性濕疹是臨床常見的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，屬于遲發型超敏反應。在早期或急性階段，臨床癥狀為紅斑、丘疹和小水皰，嚴重時出現滲出及糜爛。組織病理多表現為皮膚的表皮、真皮結構有不同程度的破壞，層次不分明，可見變性、壞死、過度角化，棘層增厚，周圍組織有水腫及炎細胞細胞彌漫性浸潤等。急性濕疹發生的病因多樣，目前認為皮膚屏障功能的障礙是急性濕疹發病的關鍵。皮膚屏障功能的正常運作主要靠其最外層的角質層細胞起“磚墻”的支架功能，其次其間的脂質起“泥漿”粘連作用。任何改變角質層結構蛋白功能、脂質正常代謝的因素都可能會導致皮膚屏障功能異常。前期研究發現，皮膚屏障功能異常是導致急性濕疹的發病的機制之一。但究竟是急性濕疹疾病中皮膚屏障的異常究竟是破壞了角質細胞結構，還是脂質結構，或者二者兼有尚需進一步證明。

DNCB多用于是設計經典的急性濕疹模型，一般多刺激小鼠耳廓皮膚[1]。但有研究發現，小鼠耳廓皮膚組織較薄，不能很好地模擬急性濕疹易發的軀干皮膚，故推薦使用大鼠背部替代小鼠耳廓[2]。大鼠背部皮膚實驗可用面積大，更利于急性濕疹皮損模型的大體觀察，如紅腫、丘疹、丘皰疹、糜爛滲出等現象。本研究使用DNCB刺激大鼠背部皮膚，發現模型組大鼠DNCB刺激后，出現明顯的急性濕疹癥狀和符合急性濕疹的病理學變化，這與我們的前期研究一致[3]，表明本實驗成功造模急性濕疹大鼠。

研究發現，急性濕疹患者正常的皮膚屏障功能被破壞，最突出的現象是角質層含水量減少，TEWL增高[4]。TEWL反映從皮膚表面蒸發的水分，代表表皮的滲透性屏障狀態，是評價皮膚功能的重要指標。研究發現，TEWL的增加與皮膚屏障功能障礙相關，而正常或減少的TEW可以作為是皮膚屏障完整或恢復的評價指標[5,6]。本研究發現，與正常組相比，模型組大鼠皮膚角質層明顯增厚，真皮層炎細胞浸潤增多，局部角質層出現缺損，同時TEWL顯著增高，提示急性濕疹大鼠產生的機制之一可能是皮膚屏障功能破壞，角質層水分的丟失增多，可能與TEWL的增加有關。

維持皮膚組織正常的新陳代謝除需角質細胞外，也離不開角質層的細胞間脂質的參與。FLG由324個氨基酸構成，存在于角質細胞內，在FLG的輔助下，角蛋白中間絲可進一步轉化為角蛋白纖維束[7]，即皮膚屏障中“磚塊”的主要成分，角質細胞的支架結構。FLG基因是編碼絲聚蛋白原的主要基因，急性濕疹患者可出現FLG活性降低，降低絲聚合蛋白的含量，從而阻礙角蛋白絲纖維束穩定結構的建立，并減少其角質化包膜中的生成，破壞其作為“磚墻”的支架作用[8,9]。絲聚蛋白的減少不僅會破壞其與角蛋白中間絲構成的角質細胞“骨架”的穩定性，同時還可導致其下游產物天然保濕因子的減少，造成皮膚干燥，最終導致皮膚屏障功能異常。本研究發現，模型組FLG基因表達低于正常組，提示模型組大鼠通過減少FLG基因表達，降低絲聚蛋白原的活性、降低絲聚合蛋白含量。

細胞間脂質是一類疏水性細胞間質，由表皮棘層細胞合成，包括神經酰胺、不飽和脂肪酸及膽固醇等成分。其合成需由細胞質內存在的板層膜結構釋放催化，該結構即板層小體是一類特殊的細胞成分，內涵豐富的脂質合成前物質和酶類。隨著表皮棘細胞的不斷上行，中層板層小體移動致顆粒層可與細胞膜相互結合，進而再排除到細胞間隙。表皮棘細胞繼續移行分化成復層板層膜結構，轉化為角質層細胞；另一方面，被排出的脂質前體則在酶的催化下，水解為脂質成分[10]。蛋白酶激活受體(PARs)屬于G蛋白偶聯受體家族，其中PAR-2在人的皮膚上廣泛表達。PAR-2信號系統的上游信號是激肽釋放酶(KLKs)，而急性濕疹時KLKs呈過表達狀態。PAR-2活化后，導致板層小體數量減少，抑制脂質轉運，導致脂質的“泥漿”黏合作用降低，破壞皮膚屏障功能[11]。此外，PAR-2可激活NF-κB 的信號轉導，介導炎癥因子的釋放，促進肥大細胞脫顆粒加重急性濕疹炎癥反應，形成惡性循環[12,13]。急性濕疹發生時，PAR-2被激活，PAR-2可抑制角質層細胞內的板層小體的分泌，大量板層小體掩埋在角質細胞內難以釋放，可引起細胞間脂質含量的減少，導致脂質的“泥漿”黏合作用降低，破壞皮膚屏障功能[9,10]。本研究發現，與正常組相比，模型組大鼠FLG基因表達降低，PAR-2含量卻增加，提示模型組大鼠可通過增加PAR-2的表達，抑制板層小體的分泌，抑制脂質轉運，破壞其間脂質的功能，導致皮膚屏障功能難以發揮其正常的作用，誘發大鼠產生急性濕疹。

綜述所述，模型組大鼠發生急性濕疹的機制可能是通過降低FLG基因表達，并增加PAR-2含量，同時破壞角質細胞及其間脂質成分，從而增加TEWL，最終破壞正常的皮膚屏障功能。