廢棄畢赤酵母核糖核酸提取條件的優化

卜光明， 顏 茜， 楊海龍*

（1.浙江瑞邦藥業股份有限公司，浙江 溫州 325000；2.溫州大學生命與環境科學學院，浙江 溫州 325035）

核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）是生物體內的高分子化合物，對維持機體的正常功能有重要作用，是特定生理條件下不可缺少的營養成分。外源性核糖核酸在機體營養、免疫調節和疾病防治等方面都有一定的功能，核酸類物質可以作為營養保健食品的添加劑，對促進兒童的生長發育、減緩老年人的衰老和病后虛弱身體的康復均有一定效果；在農牧漁業中，核酸類物質可以用作植物生長刺激劑和飼料添加劑[1-2]。

酵母中RNA含量高，適合于工業化生產，如利用釀酒酵母、產朊假絲酵母等微生物發酵制備[3-4]；同時，采用啤酒釀造產生的廢棄酵母等原料提取也是獲得RNA的重要途徑[5-6]。甲醇營養型畢赤酵母（Pichia pastoris）是能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌，作為一類優秀的表達系統，除了具有蛋白質的加工和折疊等真核表達系統所共有的優點外，還兼具諸如大腸桿菌等微生物的易于操作的特點；與動物細胞等真核表達系統相比，它具有簡便、快捷、成本低、表達水平較高等優點。畢赤酵母表達系統已被廣泛應用于植酸酶、木聚糖酶、白蛋白等產品生產基因工程菌的構建[7-10]，并實現了這些產品的工業化生產。在生產過程中會產生大量的畢赤酵母菌體，如不加以處理不僅會造成資源浪費，還會導致嚴重的環境污染[11]。為實現廢棄資源的綜合利用，本文研究了從廢棄畢赤酵母提取核糖核酸的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廢棄畢赤酵母：為植酸酶畢赤酵母基因工程菌發酵副產物，由北京中農博特生物工程技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 畢赤酵母核糖核酸的提取

提取工藝：取廢畢赤酵母泥→按其干重配成一定濃度的懸浮液100 mL→加入一定濃度的氫氧化鈉調節其pH值→在一定溫度下保溫提取一定時間→離心→棄去殘渣→上清液調節pH至等電點→過夜沉淀→離心取沉淀→核糖核酸→干燥后稱重。

1.2.2 畢赤酵母核糖核酸含量的測定[6]

采用紫外分光光度法測定，取一定量的RNA樣品，用水定容至100 mL，經適當稀釋后分別測定吸光值A260和A280，并計算A260/A280判斷所提取核糖核酸樣品的純度。由以下公式計算核糖核酸的提取率：

式中：A260為樣品波長260 nm處的吸光度值；100為樣品定容的體積；N為稀釋倍數；m為稱取的 RNA樣品重量 （g）；106為 μg轉換為 g；0.024 為 1 μg/mL RNA 的 A260。

1.2.3 畢赤酵母核糖核酸提取條件優化的試驗設計

影響畢赤酵母核糖核酸提取的因素有很多，本文利用正交試驗設計研究溶液pH值、提取溫度、提取時間、畢赤酵母濃度對核糖核酸提取的影響。根據單因素試驗結果，設計四因素三個水平正交試驗，如表1。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors table of orthogonal test

2 結果與討論

2.1 pH值對核糖核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，分別調 pH 至 7、8、9、10、11， 于 85 ℃下抽提 1.5 h，離心取上清液，調至核酸等電點（pH=2.5），過夜沉淀得到RNA，結果見圖1。由圖1可知，核糖核酸的提取率隨pH值的增大而增大，pH為9時提取率達到1.74%。而在啤酒酵母的提取中，pH=7.5時，核糖核酸的提取率和純度達到最大[12]，且隨著pH值的增大，提取率逐漸減少。啤酒酵母和畢赤酵母的細胞壁結構成分上存在一定的差異，pH較大的情況下對畢赤酵母細胞壁的作用更好，使其具有較好的通透性。因此，可以選擇pH=9進行下面的試驗。

圖1 pH值對RNA提取率的影響Fig.1 The effects of pH on the extraction of RNA

2.2 提取溫度對堿法核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，調pH至9，分別置于55℃、65℃、75℃、85℃、95℃下抽提1.5 h，離心取上清液，調至核酸等電點，過夜沉淀獲得RNA，結果見圖2。由圖2可知，溫度越高，促進了堿對畢赤酵母細胞壁的作用，使核糖核酸釋放得越多，核糖核酸的提取量隨溫度的升高而增大，溫度95℃時提取量達到1.85%。

圖2 提取溫度對RNA提取率的影響Fig.2 The effects of temperature on the extraction of RNA

2.3 提取時間對堿法核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，調pH 至9置于 95℃下，分別提取 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，離心取上清液，調至核酸等電點，過夜沉淀獲得RNA，結果見圖3。由圖3可知，在0.5～2.5 h內，核糖核酸的提取量隨時間的加長而增大，2.5 h后核糖核酸提取量不再增加，而且隨著時間的加長，核糖核酸在堿性條件下會有一部分水解成核苷酸而導致提取率降低[13]，故核糖核酸提取的最佳抽提時間為2.5 h，核糖核酸提取率達到1.92%。

圖3 提取時間對RNA提取率的影響Fig.3 The effects of reaction time on the extraction of RNA

2.4 酵母濃度對堿法核酸提取的影響

分別配置濃度為3%、6%、9%、12%、15%的畢赤酵母溶液各100 mL，調pH至 9，于95℃下抽提1.5 h，離心取上清液，調至核糖核酸等電點，過夜沉淀獲得RNA，結果見圖4。由圖4可知，畢赤酵母濃度為6%時，核糖核酸的提取率最大（2.89%），進一步提高畢赤酵母的濃度，固液比增大，在特定時間內堿性溶液與畢赤酵母作用強度有限，影響了核糖核酸的釋放，導致提取率的降低。

2.5 提取工藝的優化

根據表1的正交試驗設計進行正交試驗，得到正交試驗的結果見表2。由極差分析可知，對堿法提取畢赤酵母核糖核酸含量的影響因素依次為：抽提溫度＞溶液pH＞酵母濃度＞抽提時間。抽提時間的影響作用最小，但如果抽提時間過長，雜質會相應地增多。根據以上分析結果，確定在本實驗所選因素條件下，以酵母濃度3%，pH=10，抽提溫度為100℃，抽提時間為2.5 h時，核糖核酸提取率最高。

圖4 酵母濃度對RNA提取率的影響Fig.4 The effects of P.pastorisconcentration on the extraction of RNA

表2 正交試驗方案設計及結果（L9（34））Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.6 優化條件的驗證

以正交實驗分析法選出的最適宜提取畢赤酵母核糖核酸的條件進行5組實驗，得到的核糖核酸提取率分別為 3.05%、2.98%、3.24%、3.13%、3.16%，平均提取率為3.11%

3 小結

本文研究了堿法提取畢赤酵母核糖核酸的工藝條件，單因素試驗結果表明畢赤酵母核糖核酸提取的條件為：pH=9、時間 為2.5 h、溫度為95℃、酵母濃度為6%。經正交試驗優化確定畢赤酵母核糖核酸提取的最佳工藝條件為：pH=10，提提溫度為100℃，時間為2.5 h，酵母濃度為3%，最佳工藝條件下，核糖核酸的提取率可達3.11%。目前，以畢赤酵母為表達系統開發的基因工程均采用高密度發酵進行生產，產生大量的酵母菌體，從廢棄畢赤酵母泥中提取核糖核酸，是實現廢棄畢赤酵母綜合利用的有效途徑。