膜分離純化桔梗總黃酮及其體外抗氧化性檢測

孫曉春，黃文靜，李 鉑，任 飛，唐志書

(陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

桔梗(Platycodongrandiflorum)為桔梗科(Campanulaceae)桔梗屬植物桔梗的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效[1]。桔梗中主要含有皂苷、黃酮、多糖等有效成分[2]。研究表明黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[3,4]。王曉林等[5]采用單因素試驗及正交實驗方法研究了桔梗莖總黃酮的純化工藝和體外抗氧化性。膜分離方法主要是依據不同分子量進行分離，從而達到純化濃縮的目的[6]。本研究采用膜分離方法對桔梗總黃酮進行純化，并對純化所得桔梗總黃酮進行體外抗氧化性檢測，以期為膜分離方法的應用奠定基礎，為天然抗氧化劑的開發提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

桔梗(批號20141001，陜西興盛德藥業有限責任公司)，經陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為桔梗科植物(Platycodon grandiflorum)的干燥根。

乙醇(成都科龍試劑)，DPPH (笛醫生物科技有限公司)，總抗氧化能力試劑盒 (批號20180306，南京建成生物工程研究所)。

KQ3200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，FA2004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)，LNG-CM-101膜分離設備(上海朗極膜分離設備工程有限公司)，UV-2600紫外分光光度計(日本島津)，1510全波長酶標儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 桔梗總黃酮的制備

稱取桔梗粉末150 g，加入料液比為1：20的80%乙醇超聲提取30 min ，過濾、濃縮、冷凍干燥得桔梗總黃酮粗提物，以F表示。將桔梗總黃酮粗提物加入適量蒸餾水，配置成質量濃度為8 mg·mL-1溶液，取1L 溶液用膜分離設備進行分離。第一種方法：依次過0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔徑的膜，收集濾液；第二種方法：過0.8 μm孔徑的膜，收集濾液。第三種方法：過0.2 μm孔徑的膜，收集濾液；第四種方法：過0.05 μm的膜，收集濾液。將濾液濃縮、冷凍干燥成粉末，分別以F1、F2、F3、F4表示，稱重。

1.3 桔梗總黃酮含量檢測

總黃酮含量的測定采用 NaNO2-A1(NO3)3法[7]。總黃酮含量(%)=桔梗總黃酮質量/桔梗總黃酮粉末質量×100。

1.4 體外抗氧化性檢測

清除DPPH·活性測定方法，參照吳小燕等[8]的清除DPPH·活性測定方法。清除·OH活性測定方法，參照汪荔等[9]的清除·OH活性測定方法。總抗氧化能力測定按照試劑盒說明書操作。

1.5 統計分析

試驗所得數據利用Excel 2013進行分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 桔梗總黃酮含量檢測結果

桔梗總黃酮含量檢測結果如表1所示，桔梗總黃酮粗提物F中總黃酮含量為50.10%，依次過0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔徑的膜分離后得到的桔梗總黃酮F1中總黃酮含量為52.35%，F1粉末質量為3.0015g，這可能是因為經過3種孔徑的膜微濾后損失較大。F2、F3和F4中桔梗總黃酮含量分別為61.14%、66.58%和60.25%，F3中桔梗總黃酮含量最大，表明經過0.2 μm孔徑膜微濾后除雜效果較好。

表1 桔梗總黃酮含量檢測結果

2.2 體外抗氧化性檢測結果

2.2.1 清除·OH活性測定結果 桔梗總黃酮清除·OH活性測定結果如圖1所示，桔梗總黃酮F3對·OH清除能力最高，，濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率為68.42%，濃度為2.0 mg·mL-1時，清除率達到79.16%；其次是F2和F4，濃度為2.0 mg·mL-1時，對·OH清除率分別為73.01%和74.87%；F1和F對·OH清除能力較低，濃度為2.0 mg·mL-1時，對·OH清除率分別為66.03%和62.52%。圖1結果與表1中桔梗總黃酮含量檢測結果相一致，F3中桔梗總黃酮含量最高，對·OH清除能力亦最高。

圖1 桔梗總黃酮對·OH清除結果

2.2.2 清除DPPH·活性測定結果 桔梗總黃酮清除DPPH·活性測定結果如圖2所示，隨著桔梗總黃酮濃度的增加，對DPPH·的清除能力隨之增加，呈量效關系。對DPPH·的清除能力結果為F3>F2>F4>F>F1，與表1結果基本一致，即總黃酮含量越高，對DPPH·的清除能力越強。F3濃度為1.0 mg·mL-1時，對DPPH·清除率為90.50%.

圖2 桔梗總黃酮對DPPH·清除結果

2.2.3 總抗氧化能力測定結果 總抗氧化能力以達到同樣A值所需的FeSO4的濃度(mmol·L-1)表示，所需FeSO4的量越大，表明總抗氧化能力越高。結果如圖3所示，表明F3總抗氧化能力最高，其次為F2，而F、F1和F4三種桔梗總黃酮的總抗氧化能力無明顯差異。

圖3 桔梗總黃酮總抗氧化能力檢測結果

3 結論

桔梗總黃酮粗提物經不同孔徑膜純化后，得到4種桔梗總黃酮。結果表明，經0.2 μm孔徑膜微濾除雜效果較好，F3中桔梗總黃酮含量最高為66.58%，對·OH、DPPH·的清除作用以及總抗氧化能力均最高。F3濃度為1.0 mg·mL-1時，對·OH和 DPPH·的清除率分別為68.42%和90.50%。