甲狀腺自身免疫性抗體及甲狀腺球蛋白稀釋性能分析

唐芳 張波 張立

【摘 要】目的：通過分析甲狀腺自身抗體TRAb、TGAb、TPOAb及TG的稀釋性能，以探究各項目能否稀釋、最佳的稀釋液及最適的稀釋倍數(shù)。 方法：選取核工業(yè)四一六醫(yī)院進(jìn)行TRAb、TGAb、TPOAb及TG檢測的門診患者血清各20份，濃度超過正常參考值上限但不超過各項目最高檢測限;分別檢測各項目組的稀釋回收率，用相關(guān)分析和線性回歸進(jìn)行分析比較。用配對t檢驗分析TRAb和TGAb不同稀釋濃度下的差異。結(jié)果：TRAb使用混合陰性血清和通用稀釋液的平均回收率分別為（154.6±37.6）%和（126.3±33.2）%，CV分別為25%和27%;TGAb使用不同稀釋液時回收率分別為（231.6±182.9）%和（200.8±149.4）%，CV分別為79%和75%;TPOAb稀釋后的平均回收率為（238.9±78.3）%，CV為33%;TG的回收率在（100.7±5.2）%，CV為5.3%。TRAb和TGAb不同稀釋液稀釋所得數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：TRAb可選擇1：5進(jìn)行稀釋，所得結(jié)果需結(jié)合數(shù)據(jù)模型TRAb（混合陰性血清）期望值=0.740×測定值-0.036進(jìn)行調(diào)整;TGAb和TPOAb在目前實(shí)驗室條件下不建議稀釋;TG可選擇1：20的倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

【關(guān)鍵詞】稀釋倍數(shù) ;稀釋液;TRAb;TGAb;TPOAb;TG;回收率

【中圖分類號】R581【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）10--01

化學(xué)發(fā)光免疫分析法將高靈敏的光反應(yīng)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合，其特異性好、靈敏度高，但反應(yīng)體系明顯受溫度、濕度、基質(zhì)效應(yīng)、反應(yīng)原理、儀器、試劑性能影響，均有各自的最高檢出水平限制。在日常臨床工作中，患者某項指標(biāo)超過最高檢出水平時，往往需要對標(biāo)本進(jìn)行稀釋后重測，以得較準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。由于免疫反應(yīng)定量分析的反應(yīng)體系受基質(zhì)效應(yīng)的影響較明顯，因此在選擇稀釋液及稀釋倍數(shù)時，需格外謹(jǐn)慎[1]。本文就甲狀腺自身免疫性抗體促甲狀腺激素受體抗體（Thyrotropin-receptor antibody，TRAb）;抗甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）;甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroperoxidase antibady，TPOAb）及甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）的稀釋性能進(jìn)行分析，擬找出該檢測項目的最適稀釋液和最佳的稀釋倍數(shù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 隨機(jī)收集核工業(yè)四一六醫(yī)院2018年5月門診患者血清標(biāo)本各20份，標(biāo)本無黃疸、溶血、脂血。項目參考值范圍：TRAb <1.75IU/L;TGAb <115IU/ml;TPOAb<34IU/ml;TG 1.4-78ng/ml。所選標(biāo)本濃度超過參考值范圍上限，低于此項目的最高檢測限，如下：TRAb（10 - 40）IU/L，TGAb（900-4000）IU/ml，TPOAb（290-600）IU/ml，TG（100-500）ng/ml。收集到的標(biāo)本貯存于-20℃冰箱中，待集中分析。

1.2 方法

1.2.1 混合陰性血清制備：收集新鮮血清標(biāo)本，充分混合后測定TRAb、TGAb水平，要求所測濃度都低于各自的最低檢測水平：0.3IU/L和10.00IU/ml[2]。

1.2.2 稀釋液及稀釋方案選擇：（1）TRAb使用羅氏公司提供的通用稀釋液和混合陰性血清，分別進(jìn)行5倍、10倍、20倍及40倍稀釋。（2）TGAb使用羅氏公司的通用稀釋液和混合陰性血清，分別進(jìn)行2倍、5倍、10倍及20倍稀釋。（3）TPOAb使用羅氏公司的通用稀釋液，分別進(jìn)行5倍、10倍及20倍稀釋。（4）TG使用羅氏公司的通用稀釋液，進(jìn)行5倍、10倍及20倍稀釋[2]。根據(jù)原始血清標(biāo)本結(jié)果和各自稀釋倍數(shù)計算出各組項目期望值，實(shí)際測定結(jié)果做為實(shí)測值，回收率=實(shí)測值/期望值×100%。

1.2.3 檢測方法：電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLIA），檢測儀器為羅氏電化學(xué)發(fā)光分析儀cobase601，檢測試劑及質(zhì)控品均來自羅氏公司。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各項檢測指標(biāo)稀釋后實(shí)測值與期望值采用Pearson相關(guān)檢驗和回歸分析;TRAb與TGAb在使用不同稀釋液后所得結(jié)果之間的比較，采用配對t檢驗進(jìn)行分析。P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各項目組回收率比較

根據(jù)國家衛(wèi)計委《臨床實(shí)驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》，回收率在100±15%時為稀釋性能可接受范圍[3]。從回收率看，僅TG在選用的各個稀釋倍數(shù)的回收率滿足性能驗證的要求。2.2 各項目組Pearson相關(guān)及回歸分析（1）TRAb使用混合陰性血清稀釋液和通用稀釋液時，R2為0.954和0.876;TGAb使用混合陰性血清稀釋液和通用稀釋液以及TPOAb稀釋時，引起的變異占總變異的比例為0.483、0.573和0.788，建立的回歸方程較差。TG的R2為0.998，稀釋原因引起變異占總變異的比例分別為0.954和0.998，歸入回歸方程的變量顯著，建立的回歸方程好。

（2）各項目根據(jù)回歸分析建立的模型如下：

混合陰性血清期望值：

TRAb=0.740×測定值-0.036

TGAb=84.01+0.480×測定值

通用稀釋液期望值：

TRAb=0.478+0.588×測定值

TGAb=39.90+0.585×測定值

TPOAb=3.817+0.443×測定值

TG =1.046×測定值-0.597

其中， TRAb（通用稀釋液）、TGAb兩種稀釋液條件下及TPOAb各自所獲得的模型由于回歸平方和數(shù)據(jù)占總平方和的比例較低，所建線性模型解決不了總的平方和，模型擬合效果較差。TG模型擬合效果好。

2.3 TRAb及TGAb采用混合陰性血清和通用稀釋液稀釋后各回收率配對t檢驗分析 結(jié)果顯示，不論是TRAb還是TGAb，兩種稀釋液的檢測結(jié)果均有顯著差異（P<0.05）。

3 討論

甲狀腺自身免疫性疫病（autoimmune thyroid disease，AITD）主要包括自身免疫性甲狀腺功能減退（autoimmune hypothyroidism，AIH）和Graves病。AITD在男性和女性中的發(fā)病率分別為0.2%和2.0%[4]。Graves病在我國人群患病率約為1.2%[5]，約占所有甲亢的85%[6];AIH又分為甲狀腺腫型即橋本甲狀腺炎（Hashimotos thyroiditis，HT）和非甲狀腺腫型即原發(fā)性黏液性水腫（Primary myxedema，PM）。TRAb、TGAb、TPOAb是目前臨床常用于AITD的實(shí)驗室檢查。TRAb按照功能將其分為刺激型抗體（thyroid stimloating antibody ，TSAb）與抑制型抗體（thyroid blocking antibody ，TBAb）。TSAb主要見于Graves病，它在臨床用于Graves病時期診斷、提示復(fù)發(fā)和判斷是否停藥中有重要的價值，目前實(shí)驗室化學(xué)發(fā)光法僅檢測總的TRAb。TGAb是診斷甲狀腺自身免疫性疾病的一個特異性指標(biāo)，在HT患者血清中，TGAb陽性檢出率可達(dá)90%-95%;TPOAb是HT的診斷標(biāo)志物，70%以上的甲狀腺功能亢進(jìn)患者、阿托品甲狀腺炎和原發(fā)性黏膜水腫患者體內(nèi)均存TPOAb。TG對于因甲狀腺腫瘤而接受甲狀腺全切的患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有一定的提示作用。

本次研究TRAb、TGAb、TPOAb及TG主要用電化學(xué)發(fā)光免疫分析。由于疾病的檢測、治療、療效監(jiān)測的需要，臨床醫(yī)生在日常工作中，常常需要檢驗科給出一個具體的數(shù)據(jù)這時，需要對樣本進(jìn)行稀釋。由于免疫反應(yīng)遵循“海德堡曲線”，當(dāng)對超過線性的樣本進(jìn)行稀釋時，因基質(zhì)效應(yīng)、操作等引起的誤差，將隨著稀釋倍數(shù)的增大，所有的誤差也同時放大相應(yīng)的倍數(shù)，誤差就會更明顯。

本研究中，根據(jù)廠家試劑說明書和實(shí)際工作所能具備的條件，4個分析項目根據(jù)各自不同的需要選用了不同的稀釋液和稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢測。TRAb結(jié)果相對較好的是做5倍和10倍稀釋的結(jié)果;在稀釋液的選擇上，混合陰性血清較通用稀釋液好。在使用混合陰性血清進(jìn)行的檢測中，TRAb選著5倍稀釋后稀釋數(shù)據(jù)的相關(guān)性良好（0.977），實(shí)驗室根據(jù)所建的數(shù)據(jù)模型，進(jìn)行反算，得到的結(jié)果回收率能滿足質(zhì)量管理的要求。但由于實(shí)驗數(shù)據(jù)有限，模型是否能在日常的工作中運(yùn)用，還需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗正。

TGAb無論使用混合陰性血清還是通用稀釋液，稀釋后數(shù)據(jù)的平均回收率均高，不同水平的回收率變異明顯（回收率>200%，SD>100%，CV>70%），各數(shù)據(jù)間無較明顯的規(guī)律可循，因而通過實(shí)驗結(jié)果，認(rèn)為TGAb不宜進(jìn)行稀釋。TGAb本身檢測范圍較寬，但造成稀釋回收率差是否與試劑本身的不穩(wěn)定因素有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

TPOAb按照廠家試劑說明書的建議，采用的稀釋液是通用稀釋液，稀釋倍數(shù)5倍進(jìn)行操作，試驗數(shù)據(jù)回收率仍然很大（206%-270%，SD=33%），因此，建議是在日常工作中不宜選擇稀釋操作。

TG稀釋后具有很好的回收率（R2=0.998），可以初步判斷各水平的回收率符合性能驗證的要求[3]。在10倍（廠家建議的稀釋倍數(shù)）、20倍稀釋得到的數(shù)據(jù)均符合質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)（93.9%-110%）。在日常工作中，選擇20倍做為TG的稀釋倍數(shù)，可以得到更寬的檢測范圍，所得的結(jié)果也是可靠的。

通過本研究，提示因化學(xué)發(fā)光免疫中抗原抗體反應(yīng)中干擾物對分析過程的影響，實(shí)驗室在開展新項目或改良試驗方法時，在參考廠家給出的性能參數(shù)時，應(yīng)該對這些性能參數(shù)進(jìn)行驗證。其中TPOAb及TGAb試驗結(jié)果不能滿足實(shí)驗室要求，能否通過降低稀釋比例，或通過使用光電子數(shù)計算的方式得到結(jié)果，因本次實(shí)驗未涉及，還需進(jìn)一步驗證。

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