18種植物乙醇提取物對二斑葉螨的殺螨活性

郭宇俊, 韓俊艷, 李志強, 楊詩博

(沈陽大學 城市有害生物治理與生態安全遼寧省重點實驗室, 遼寧 沈陽 110044)

二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch)可寄生于玉米、高粱、蘋果、桃、杏、梨、李、葡萄、櫻桃、棉、豆類等多種植物中,是一種世界性的有害生物[1-2],由于其具有高繁殖力和一代短的特點,在短期內可以達到非常高的種群密度,對農作物構成嚴重威脅.二斑葉螨傷害植物后,植物的葉綠素含量減少,從而使農作物大量減產.目前對二斑葉螨的治理主要使用傳統的化學農藥,長期使用化學農藥不僅造成嚴重的環境污染,同時導致害螨產生抗藥性,害螨藥物防治效果降低,加重了害螨對農作物造成的損失[3-6].據統計,我國對植物危害嚴重的螨類約40余種,對殺螨劑的需求量為生產量的4倍,供不應求[7].目前人們越來越重視生態環境問題,在人口迅速增長、環境污染嚴重的今天,研究和開發高效、低毒和對環境友好的植物源農藥具有重要意義.

植物本身含有次生代謝物用于抗御病蟲害,次生代謝物能與害蟲長期協同進化,不耐受,對環境污染低,對人畜健康無害.我國地大物博,植物資源豐富,植物源殺螨劑開發潛力大,能夠為尋找殺螨植物提供堅實的基礎.目前我國高精密儀器的研制與生物技術的迅速發展,已經使我國的植物源農藥處于國際上游水平.盡管研制植物性殺螨劑的成本相對較高,但隨著社會的發展,人們生活水平不斷提高,市場需求會越來越大.由此可見,植物源殺螨劑在我國的發展前景十分廣闊,在今后的害蟲綜合防治中具有重要意義[8].筆者在遼寧大連瓦房店市山區采集了14科18種植物,制備了乙醇提取物,對二斑葉螨雌成螨和卵進行了室內觸殺活性測定及植物毒力測定,為篩選出高效的殺螨活性物質提供了數據基礎.

1 材料與方法

1.1 植物材料

從遼寧省瓦房店市山區采集18種植物作為供試材料,植物名稱和供試部位見表1.將植物材料洗凈陰干后,分別放入粉碎機中粉碎,過直徑0.180 mm的篩子,密封后保存于冷藏柜中備用.

(1) 醇提物的制備.分別稱取20 g植物粉碎物,加入5倍體積的體積分數為95%的乙醇,室溫下浸提3 d(每隔5 h振蕩1次),過濾.重復操作,每種植物浸提3次,將3次濾液合并,用旋轉蒸發儀減壓濃縮,獲得膏狀提取物,稱重,計算提取率后于冷藏柜中保存.

表1 18種測試植物名錄Table 1 List of 18 tested plants

提取率的計算方法為:

(2) 測試物的準備.取膏狀提取物置于錐形瓶中,加入少量無水乙醇溶解后,再加入體積分數為0.3%的吐溫-80水溶液溶解制成質量濃度為10 mg·mL-1的供試藥液,備用.

1.2 供試螨

二斑葉螨由遼寧省城市有害生物治理與生態安全重點實驗室飼養.飼養在溫度為(25±1)℃、濕度為60%～65%,每天光照與黑暗時間比為 16 h∶8 h的人工氣候箱中.

1.3 測試方法

(1) 二斑葉螨觸殺活性測定.采用玻片浸漬法[9]并稍加改進,將雙面膠粘于載玻片的一端,用細頭油畫筆輕輕挑取活潑的雌成螨,將其背部粘在雙面膠上,保證螨足不被粘在雙面膠上,在顯微鏡下剔除不合格的雌成螨,用油畫筆觸動螨體,螨足不動者為不合格.最終保留每個載玻片上螨的頭數n=30.將載玻片一端置于供試藥液或空白對照溶液中,5 s后取出,用濾紙吸干螨四周多余的藥液,放入人工氣候箱中.24 h后觀察螨蟲存活數量,用油畫筆觸動螨體,螨足不動者為死亡,計算校正死亡率.以質量濃度為0.3%吐溫-80水溶液為對照,每個處理重復3次.

校正死亡率計算公式如下:

(2) 螨卵觸殺活性測定.選用葉片浸漬法[10]并略加改良,在培養皿中放入具有一定濕度的棉花,將新鮮的黑豆葉片放在棉花上,用細頭油畫筆輕輕挑取活潑的雌成螨,用濕棉花將葉片圍好,以防止害螨逃逸.待雌成螨產卵后,在顯微鏡下剔除多余的卵,留下30枚卵,將葉片浸入植物提取物供試藥液或質量濃度為0.3%吐溫-80對照藥液中,5 s后取出,用濾紙小心吸去多余藥液.置于人工氣候箱中培養,7 d后觀察孵化情況,沒有孵化的卵視為死亡,統計各測試組螨卵的孵化率,每個處理重復3次.

(3) 高效殺螨活性植物提取物對二斑葉螨的毒力測定.將波斯菊、銀杏、紫花地丁、四季海棠和煙草提取物配制成12.8、6.4、3.2、1.6和0.8 mg·mL-15個不同質量濃度的供試藥液,采用玻片浸漬法對二斑葉螨的雌成螨進行毒力活性測定.

1.4 數據統計分析

使用SPSS 18軟件Probit分析,并計算毒力回歸方程、半數致死質量濃度(LC50)及95%置信區間.利用DPS軟件進行Duncan顯著性分析.

2 結果分析

2.1 18種植物的乙醇提取物提取率

由表2可見,植物用體積濃度為95%的乙醇浸提,槐樹的浸提率最低,僅為6.4%,蒲公英的浸提率最高,為17.05%.18種供試植物的乙醇提取率由高到低依次為:蒲公英、酸棗、爬山虎、狗尾巴草、蒼耳、三葉草、紫花地丁、艾草、回回蒜、楸樹、四季海棠、銀杏、煙草、龍葵、波斯菊、平車前、水柳、槐樹.

2.2 18種植物乙醇提取物對二斑葉螨的觸殺作用

由表2可見,當質量濃度為10 mg·mL-1的18種植物乙醇提取物處理二斑葉螨24 h后,所測試的18種植物乙醇提取物對二斑葉螨雌成螨有不同程度的觸殺作用.波斯菊、煙草、銀杏殺螨作用較強,校正死亡率達到90%以上.四季海棠、紫花地丁、平車前、龍葵、狗尾巴草、三葉草、爬山虎、蒲公英和回回蒜的乙醇提取物也有一定的殺螨活性,校正死亡率在50%～80%.槐樹、楸樹、艾草、酸棗、蒼耳、水柳的乙醇提取物殺螨作用較弱,校正死亡率低于50%.

表2 18種植物乙醇提取物對二斑葉螨雌成螨的觸殺活性(n=30)Table 2 Toxicity of ethanol extracts of 18 plants against adult female mites of Tetranychus urticae Koch (n=30)

注: 表中縱列數據后字母,小寫字母相同者表示在5%水平差異不顯著,大寫字母相同者表示在1%水平極不顯著.

2.3 18種植物乙醇提取物對二斑葉螨卵的觸殺作用

18種植物乙醇提取物對二斑葉螨卵的觸殺活性結果見表3.波斯菊、蒼耳、煙草、龍葵、銀杏、紫花地丁和酸栆的乙醇提取物對二斑葉螨卵的孵化有較好的抑制作用,四季海棠、槐樹、艾草、三葉草、爬山虎、蒲公英的乙醇提取物對螨卵的觸殺活性較弱,楸樹、狗尾巴草、平車前、回回蒜、水柳的乙醇提取物對二斑葉螨卵無觸殺作用.

表3 18種植物乙醇提取物對二斑葉螨卵的觸殺活性(n=30)Table 3 Contact toxicity of 18 Plant ethanol extracts against eggs of Tetranychus urticae Koch(n=30)

續表3

植 物 名 稱孵化率/%水柳Homonoia ripari93.30士1.96abcABC紫花地丁Viola philippica77.77士3.87ghiFGH三葉草Trifolium sp84.43士1.96efDEF爬山虎Parthenocissus tricuspidata87.80士1.91deBCDE煙草Nicotiana tabacum L73.33士5.77ijH0.3%吐溫-80水溶液97.80士1.91aA

注: 表中縱列數據后字母,小寫字母相同者表示在5%水平差異不顯著,大寫字母相同者表示在1%水平極不顯著.

2.4 5種植物乙醇提取物對二斑葉螨的毒力作用比較

18種植物乙醇提取物通過對二斑葉螨雌成螨和卵進行觸殺活性測定,發現波斯菊、銀杏、煙草、四季海棠和紫花地丁5種植物提取物對二斑葉螨表現出較好的生物活性.將5種植物的乙醇提取物分別配成12.8、6.4、3.2、1.6、和0.8 mg·mL-15個不同質量濃度的供試藥液,對二斑葉螨雌成螨的觸殺毒力進行線性回歸分析,進一步評價這5種植物提取物對二斑葉螨的毒力.

由表4可見,波斯菊、銀杏、煙草、紫花地丁、四季海棠5種植物乙醇提取物物對二斑葉螨雌成螨均表現出較好的觸殺效果,LC50分別為3.178、3.642、3.200、5.535和5.522 mg·mL-1.

表4 5種植物乙醇提取物對二斑葉螨雌成螨的毒力(n=30)

注: 計算對雌成螨的LC50時用處理 24h后的實驗數據.

3 討論與結論

本文對在遼寧大連瓦房店市山區采集的14科18種植物的乙醇提取物進行了殺螨活性測定,試驗結果顯示,波斯菊、煙草、銀杏殺螨作用較強,校正死亡率達到 90%以上.18種植物乙醇取物對二斑葉螨卵的觸殺試驗結果顯示,波斯菊、龍葵、蒼耳、煙草、銀杏、紫花地丁和酸棗的乙醇提取物對二斑葉螨卵的孵化有較好的抑制作用;波斯菊的乙醇提取物對二斑葉螨雌成螨與卵的觸殺作用均較明顯.波斯菊(Cosmos bipinnatus),又叫秋英,喜光喜溫暖,為菊科秋英屬1年生或多年生草本植物,其既是一種重要的觀賞性植物[11],也是一種中藥材.波斯菊因其花期短、花色種類多,生命力強,易于生長,環境效益好等特點,常以草花混播的形式廣泛應用于園林綠化中[12].王丹等[13]發現波斯菊的根、莖葉和花序等不同部位的浸液對矢車菊和硫磺菊的幼苗根的生長具有抑制作用,對硫磺菊苗高有促進作用.低濃度的波斯菊浸液對矢車菊和雞冠花幼苗生長有明顯的促進作用[14].波斯菊藥用價值很高,常外用治癰瘡腫毒,因其能夠治療慢、急性痢疾, 民間常稱其為“痢疾草”,劉丹丹等[15]研究波斯菊水提物對糖尿病小鼠肝臟組織的形態影響,發現波斯菊種子水提物能夠調節糖尿病小鼠肝臟糖代謝作用;朱浩等[16]發現波斯菊種子水提物能夠延緩糖尿病小鼠肝腎損傷;賈利紅等[17]發現質量濃度為0.5mg·mL-1的波斯菊種子水提物能夠控制糖尿病小鼠血糖接近正常水平;楊春華等[18]發現混有波斯菊成分的藥品能夠促進小鼠皮膚缺損性創傷愈合.波斯菊屬于菊科植物,近年來菊科植物在開發殺蟲植物源農藥方面的價值日益受到關注,菊科植物含有多種光活化毒素,萬壽菊、孔雀藍等對致倦庫蚊有很好的光活化活性[19].張天柱等[20]發現鯉腸和萬壽菊提取物在近紫外光下對淡色庫蚊和松材線蟲表現出較強的光活化毒殺作用.李云壽等[21]對14種菊科植物分別用6種溶劑提取活性成分進行菜青蟲的殺蟲活性實驗,發現黃花蒿和魚眼草等乙醇和甲醇的提取物的殺蟲活性成分較高.菊科植物紫莖澤蘭提取物能夠有效防治粘蟲[22].本試驗發現波斯菊提取物具有殺葉螨作用,可能與其他菊科殺蟲植物具有相似的活性成分與作用機制.

總之,本試驗結果表明波斯菊具有殺螨活性,有必要進行深入研究.試驗只選擇1種害螨即二斑葉螨為研究對象,試驗結果不能完全替代所有螨類均成立,為了完善波斯菊提取物的殺螨譜,應在未來的試驗中增加其他螨類作為試驗對象.試驗應進一步研究其他有機溶劑提取物對二斑葉螨的殺螨活性,以及進一步通過純化有效成分,尋找活性單體,闡明毒理機制,為開發新型植物殺螨劑奠定基礎.