山西老陳醋中芽孢桿菌的RAPD分型及其與性狀之間的關系

賈瑞娟，陳旭峰，梁 楷，王如福，許 女*

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西農業大學 實驗教學中心，山西 晉中 030801；3.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400）

作為中國“四大名醋”之一的山西老陳醋，其采用傳統自然固體發酵并結合獨特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨特的酸、綿、香、甜風味與口感[1]。老陳醋的獨特風味得益于微生物菌群的生長和代謝以及復雜的協同作用，芽孢桿菌（Bacillus）也是山西老陳醋發酵生產過程中的重要微生物種群，其在老陳醋風味和功能成分的形成中起到重要作用。王進龍[2]從山西老陳醋中分離出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

芽孢桿菌具有很強的分泌蛋白的能力，能產生大量的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等，提高原料的利用率[3]。史改玲[4]從山西老陳醋成熟醋醅中分離篩選出的甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）CP-1576淀粉酶活力最高（61.40 U/mL），球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）CP-2436的纖維素酶活力最高（54.99 U/mL），地衣芽孢桿菌CP-1853的蛋白酶活力最高（22.80 U/mL）；王進龍[2]從山西老陳醋大曲中分離出的芽孢桿菌BA8的糖化酶活力為41.01 U/mL，BP6的蛋白酶活力為28.29 U/mL。

乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川芎嗪的前體物質[5]，而芽孢桿菌產乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更強、更穩定[6]。在國內外，乙偶姻生產菌種的篩選、育種、發酵主要集中于芽孢桿菌。高文睿等[7]從涼州熏醋中篩選出高產乙偶姻（2.376 mg/mL）的芽孢桿菌Y4；張顯[8]采用傳統誘變方法對枯草芽孢桿菌JNA 3-10進行復合誘變，獲得一株2,3-丁二醇脫氫酶（2,3-butanediol dehydrogenase，BDH）缺失型乙偶姻高產突變株JNA-UD-6，乙偶姻產量為53.9 g/L。芽孢桿菌在陳醋中除產乙偶姻外，還產多酚類物質，從而賦予山西老陳醋抗氧化的功能，郇阿梅等[9]從四川傳統麩醋醋醅中篩選出一株芽孢桿菌YB-32，培養24h后總酚產量為263.6 μg/mL。另外，芽孢桿菌的代謝產物與發酵體系中的其他物質發生反應，生成一些風味物質，可以很好地改善食醋風味。

隨機擴增多態性脫氧核糖核酸（randomamplifiedpoly morphicdeoxyribonucleicacid，RAPD）技術是一種基于基因組聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的多態性分析的分子分型技術[10]。近年來，RAPD用于保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）分型的研究較多[11]，但關于芽孢桿菌菌種間基因分型的研究鮮有報道。本研究從山西老陳醋釀造過程的醋醅中分離芽孢桿菌，采用分子生物學技術對其進行鑒定，并采用RAPD技術對其進行菌株分型，明確山西老陳醋芽孢桿菌的主要種類；在此基礎上，對芽孢桿菌的酶、乙偶姻、多酚、總酯的生產能力進行測定，進一步探討了型別與菌株特性之間的關系，從中篩選出優良菌株，以期豐富山西老陳醋生產強化菌株，對食醋的營養、功能、風味、生產效率的提高等都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醋醅：取自山西東湖醋廠老陳醋醋酸發酵第0天、1天、3天、5天、7天、9天、11天醋醅缸中表層至底層20cm處的醋醅。

1.1.2 培養基與試劑

MRS培養基：青島高科園海博生物科技有限公司。

細菌DNA提取試劑盒：北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物：由深圳華大基因公司合成；DNA Maker、MIX：上海生工生物工程有限公司；福林試劑、肌酸、沒食子酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T100型PCR儀、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；5417R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山西老陳醋中芽孢桿菌的分離

無菌條件下，稱取25 g樣品于內置玻璃珠的225 mL無菌生理鹽水中，室溫、140 r/min條件下振蕩培養20 min，使其混勻。對樣品進行梯度稀釋，選取梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布于MRS固體培養基平板中，37℃靜置培養1～2 d。選擇具有30～300個菌落的平板，并挑取平板上表面粗糙、菌落形態較大的單個菌落進行分離純化。

1.3.2 山西老陳醋中芽孢桿菌的鑒定

對分離純化的菌株進行革蘭氏染色，并觀察菌株的菌落和細胞形態，選取革蘭氏陽性、有芽孢的桿狀菌株進行分子生物學鑒定。

采用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組，以其為模板，采用引物27F（5′-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3′）對細菌的16S rDNA進行PCR擴增[12]。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后進行測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）的Genebank數據庫中進行BLAST比對，選取同源性較高的菌株，利用MEGA5.1軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.3 山西老陳醋中芽孢桿菌的基因分型

將分離純化的芽孢桿菌菌株分別接種于MRS液體培養基，37℃、140 r/min條件下培養24 h，以基因組DNA為模板，采用引物（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）[13]進行PCR擴增；PCR擴增體系：引物3 μL，模板3.5 μL，2×MIX 15 μL，雙蒸水（ddH2O）10.5 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，進行RAPD分型分析。

1.3.4 山西老陳醋中優良芽孢桿菌的篩選

將分離的30株芽孢桿菌接種于MRS液體培養基中，37℃、140 r/min條件下培養24 h，發酵液經8 000 r/min離心10 min，取上清，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[14]測定芽孢桿菌發酵液的糖化酶酶活、纖維素酶酶活；采用福林-酚比色法測定蛋白酶酶活[15]、多酚含量[16]；采用O'Meara-比色法[17]測定乙偶姻含量；采用氫氧化鈉皂化法[18]測定總酯含量。

2 結果與分析

2.1 山西老陳醋中芽孢桿菌的分離與鑒定

從山西老陳醋醋酸發酵過程的醋醅中共分離得到30株芽孢桿菌，分別為菌株10、18、19、28、33、38、59、61、140、146、250、253、277、285、290、510、665、670、804、936、1145、1146、1463、1576、1882、1918、1959、1986、2035、2372，其中6株典型芽孢桿菌的菌落和細胞形態見圖1和表1。

由圖1和表1可知，菌株665的菌落呈圓形，邊緣齒狀，中間凹陷，乳白色；菌株1882的菌落邊緣褶皺，中間凸起成雪花狀，淡黃色；菌株2035的菌落近似圓形，扁平，邊緣平整，干燥；菌株1576的菌落呈圓形，邊緣齒狀，中間凸起成圈，乳白色；菌株936的菌落邊緣褶皺，中間凹陷，扁平，淡黃色；菌株670菌落呈圓形，邊緣褶皺，中間凹陷，扁平，乳白色。菌落形態多不透明，細胞均呈桿狀，革蘭氏陽性（G+）。經菌落和細胞形態觀察，初步鑒定30株分離菌株均為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖1 山西老陳醋中典型芽孢桿菌的菌落（A）和細胞形態（1 000×）（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(1 000×)(B)of typicalBacillusfrom Shanxi aged vinegar

表1 山西老陳醋中典型芽孢桿菌的菌落和細胞形態結果Table 1 Results of colony and the cell morphology of typicalBacillus from Shanxi aged vinegar

30株芽孢桿菌經16S rDNA測序比對并構建系統進化樹，結果見圖2。

圖2 山西老陳醋中芽孢桿菌的16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar based on the 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株10、18、19、28、1146、1959、253、277、285、290、665與模式菌株BacilluslicheniformisstrainKW55P（MH424451.1）、BacilluslicheniformisstrainDC3-1（EU257697.1）、BacilluslicheniformisstrainSPB22（KY082733.1）聚于一支，親緣關系最近，可達99%，因此，鑒定這些菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株33、59、1463、1986、2035、2372與模式菌株Bacillus subtilisstrain SY1（JX489618.1）、BacillussubtilisstrainS12（MH234565.1）、Bacillussubtilisstrain Y27（KF641814.1）聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定這些菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）；菌株38、146、250、510、804、1145、1882、1918與模式菌株Bacillus amyloliquefaciensstrain CD2901（KC492052.1）聚于一支，親緣關系也較近，鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；同理，鑒定菌株140、1576為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）；菌株61、936為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；菌株670為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。

綜上，30株芽孢桿菌中11株為地衣芽孢桿菌，8株為解淀粉芽孢桿菌，6株為枯草芽孢桿菌，2株為甲基營養型芽孢桿菌，2株為短小芽孢桿菌及1株為沙福芽孢桿菌，分別占芽孢桿菌的36.67%、26.67%、20.00%、6.67%、6.67%、3.33%。

2.2 山西老陳醋中芽孢桿菌的基因分型

為了解山西老陳醋中芽孢桿菌種內菌株的基因多樣性，采用RAPD技術對30株芽孢菌菌株進行基因分型，結果見圖3。

圖3 山西老陳醋中芽孢桿菌的RAPD基因分型結果Fig.3 RAPD genotyping results ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖3A可知，11株地衣芽孢桿菌主要呈現Ⅰ、Ⅱ2個型別，Ⅰ型又分為Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅱ2個亞型，其中菌株10、18、19、28為Ⅰ-Ⅰ型，菌株1146、1959為Ⅰ-Ⅱ型，其余菌株253、277、285、290、665均為Ⅱ型。由圖3B可知，8株解淀粉芽孢桿菌也被分成Ⅰ、Ⅱ2個型別，菌株38為Ⅰ型，而菌株146、250、510、804、1145、1882、1918被歸屬為Ⅱ型。由圖3C可知，6株枯草芽孢桿菌被分成Ⅰ、Ⅱ2個型別，Ⅰ型又分為Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅱ2個亞型，其中菌株33為Ⅰ-Ⅰ型，菌株59為Ⅰ-Ⅱ型，菌株1463、1986、2035、2372均為Ⅱ型。由圖3D可知，2株甲基營養型芽孢桿菌菌株為同一基因型。由圖3E可知，2株短小芽孢桿菌屬于不同的型別。綜上所述，來源于老陳醋醋酸發酵過程中的30株芽孢桿菌具有菌株基因多樣性，為菌株的特性篩選提供了遺傳基礎。

2.3 山西老陳醋中優良芽孢桿菌的篩選

2.3.1 芽孢桿菌產糖化酶能力的測定

淀粉酶可以催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖和麥芽糖。用淀粉酶做糖化劑來釀造食醋，可以提高食醋原料利用率，提高產量，降低生產成本，縮短食醋生產周期[19]。淀粉酶主要有α-淀粉酶和糖化酶，α-淀粉酶是將大分子淀粉水解成中等和低分子物質，產生大量新的非還原性末端，糖化酶則將α-淀粉酶水解出的一些中、低分子產物水解為可直接利用的葡萄糖。芽孢桿菌能夠分泌產生糖化酶，研究較多的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[20]。30株芽孢桿菌糖化酶活力測定結果見圖4。

圖4 山西老陳醋中芽孢桿菌糖化酶活力的測定結果Fig.4 Determination results of glucoamylase activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖4可知，30株芽孢桿菌的糖化酶酶活在20～120U/mL范圍內，其中解淀粉芽孢桿菌1145（112.45 U/mL）、解淀粉芽孢桿菌38（89.68 U/mL）、沙福芽孢桿菌670（84.24 U/mL）的糖化酶活較高，但低于徐穎[21]從土壤中篩選的枯草芽孢桿菌的糖化酶酶活（784 U/mL），不同來源的芽孢菌菌株產糖化酶的能力顯著不同，這與菌株的生境直接相關，但醋醅中分離、篩選的土著優良高產糖化酶芽孢桿菌對陳醋釀造環境的適應性，具有其他來源菌株無可比擬的優勢。另外，Ⅱ型地衣芽孢桿菌的糖化酶酶活性（38～64U/mL）顯著高于Ⅰ型（18～36 U/mL）；相似地，Ⅱ型枯草芽孢桿菌的糖化酶酶活（59～68 U/mL）也顯著高于Ⅰ型（31～45 U/mL），表明同種同型別芽孢桿菌產糖化酶的能力具有相似性，同種不同型別芽孢桿菌產糖化酶的能力具有差異性。

2.3.2 芽孢桿菌產蛋白酶能力的測定

在食醋制作過程中，蛋白酶分解原料中的蛋白成分，提高陳醋中氨基氮的含量，同時提高了老陳醋的澄清度和穩定性[22]。蛋白酶主要來源于微生物，其中芽孢桿菌是蛋白酶的重要生產菌株。30株芽孢桿菌的蛋白酶活力測定結果見圖5。

圖5 山西老陳醋中芽孢桿菌蛋白酶活力的測定結果Fig.5 Determination results of protease activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖5可知，30株芽孢桿菌發酵液的蛋白酶酶活在3～35 U/mL范圍內，其中解淀粉芽孢桿菌38（34.53 U/mL）、甲基營養型芽孢桿菌1576（27.75 U/mL）、甲基營養型芽孢桿菌140（21.62U/mL）發酵液的蛋白酶酶活較高，但低于黃家駟等[23]從酒曲中篩選出的地衣芽孢桿菌的酶活（180U/mL）。這可能與芽孢菌的來源不同有關。Ⅰ型地衣芽孢桿菌的蛋白酶酶活（6～16 U/mL）顯著高于Ⅱ型（4～9 U/mL）；同理，Ⅰ型解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶酶活（34.53 U/mL）高于Ⅱ型（13～19 U/mL），結果表明，不同型別芽孢桿菌的特性差異性較大，而同型別菌株特性相似。

2.3.3 芽孢桿菌產纖維素酶能力的測定

纖維素酶是一種具有催化纖維素分解成葡萄糖的生物活性蛋白質，纖維素酶能破壞植物細胞壁，便于淀粉、蛋白質、脂肪類物質的釋放，高粱作為陳醋生產原料，其纖維素含量高達4%～10%，纖維素酶可以加快發酵速度，提高食醋的產量和原料利用率。本研究中30株芽孢桿菌的纖維素酶活力測定結果見圖6。

由圖6可知，30株芽孢桿菌的纖維素酶酶活在9～35 U/mL范圍內，其中沙福芽孢桿菌670、解淀粉芽孢桿菌510、枯草芽孢桿菌2372的纖維素酶活較高，分別為35.38 U/mL、33.61 U/mL、33.02 U/mL，纖維素酶酶活均高于董丹等[24]從酒醅中篩選出的枯草芽孢桿菌XWS-1（26.4U/mL）。從菌株基因分型來看，Ⅱ型枯草芽孢桿菌產纖維素酶（22～33U/mL）的能力明顯高于Ⅰ型（20～21U/mL），其余同種不同型別的芽孢桿菌、同種同型別的芽孢桿菌產纖維素酶能力相似。

圖6 山西老陳醋中芽孢桿菌纖維素酶活力的測定結果Fig.6 Determination results of cellulase activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

2.3.4 芽孢桿菌產乙偶姻能力的測定

乙偶姻是山西老陳醋中重要功能成分川芎嗪的前體物質，國內外產乙偶姻菌株的篩選、育種、發酵集中于芽孢桿菌。30株芽孢桿菌乙偶姻生產能力的測定結果見圖7。

圖7 山西老陳醋中芽孢桿菌產乙偶姻能力的測定結果Fig.7 Determination results of acetoin production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖7可知，30株芽孢桿菌的乙偶姻產量在0.3～1.2 mg/mL范圍內，其中甲基營養型芽孢桿菌1576的乙偶姻產量最高，為1.15 mg/mL，其次是高產糖化酶和蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌38（1.05 mg/mL），顯著高于王霜等[25]從兼香型白酒酒醅中篩選到的地衣芽孢桿菌LS9的乙偶姻生產能力（0.065mg/mL）。Ⅰ型解淀粉芽孢桿菌的乙偶姻產量（1.05 mg/mL）顯著高于Ⅱ型（0.52～0.94 mg/mL），而且Ⅰ型枯草芽孢桿菌的乙偶姻產量（0.69～0.76 mg/mL）也同樣高于Ⅱ型（0.52～0.58 mg/mL），進一步表明，同種同型別的芽孢桿菌的優良特性具有相似性，不同型別的芽孢菌其特性具有差異性。

2.3.5 芽孢桿菌產多酚能力的測定

多酚類物質具有抗氧化、強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂肪、抑制細菌與癌細胞生長等多種生理活性功能[16]。30株芽孢桿菌的多酚產量測定結果見圖8。

圖8 山西老陳醋中芽孢桿菌產多酚能力的測定結果Fig.8 Determination results of polyphenols production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖8可知，30株芽孢桿菌的多酚產量在120～430μg/mL范圍內，其中解淀粉芽孢桿菌804（428.35μg/mL）、解淀粉芽孢桿菌1145（407.07μg/mL）、地衣芽孢桿菌1146（403.71μg/mL）的多酚產量較高，而高產糖化酶、纖維素酶和乙偶姻的解淀粉芽孢桿菌38產多酚能力次之，產量為401.36μg/mL。Ⅰ-Ⅱ型地衣芽孢桿菌的多酚產量在320～400 μg/mL范圍內，而Ⅱ型地衣芽孢桿菌在260～325 μg/mL范圍內。

2.3.6 芽孢桿菌產總酯能力的測定

芽孢菌代謝產生的乳酸、蘋果酸、酒石酸、丙酮酸等有機酸，可以與醇類物質酯化生成酯類物質，豐富老陳醋味感與口感。30株芽孢桿菌的總酯生產能力測定結果見圖9。

圖9 山西老陳醋中芽孢桿菌產總酯能力的測定結果Fig.9 Determination results of total esters production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖9可知，30株芽孢桿菌的總酯產量在6.98～9.62 g/100 mL范圍內，其中解淀粉芽孢桿菌38產總酯能力（9.62 g/100 mL）最強；其次為解淀粉芽孢桿菌1882、解淀粉芽孢桿菌1145，分別為9.54 g/100 mL、9.05 g/100 mL。

綜上，30株芽孢桿菌中解淀粉芽孢桿菌38產糖化酶、蛋白酶、乙偶姻、多酚和總酯的能力均較高，為優良菌株。

3 結論

從山西老陳醋醋酸發酵過程的醋醅中共分離出30株芽孢桿菌，經分子生物學鑒定，其中11株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），8株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），6株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），2株為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus），2株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），1株為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。采用RAPD技術對其進行基因分型，發現芽孢桿菌種內具有基因多樣性。另外對30株芽孢桿菌產酶、乙偶姻、多酚、總酯的能力進行篩選，發現同種同型別的芽孢桿菌產酶、乙偶姻、多酚、總酯的能力具有相似性；但同種不同型別的芽孢桿菌的特性具有差異性，并且篩選出1株產糖化酶（89.68U/mL）、蛋白酶（34.53U/mL）、乙偶姻（1.05 mg/mL）、多酚（401.36 μg/mL）、總酯（9.62 g/100 mL）能力均較高的解淀粉芽孢桿菌38，證明了芽孢桿菌作為山西老陳醋強化直投式發酵劑具有巨大的開發潛力。