柚子酒發酵條件優化

李敏杰，熊 亞*

（1.攀枝花學院 生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術中心，四川 攀枝花 617000）

柚子（Citrus maxima）又名文旦、香欒、朱欒、內紫等[1]。柚子含多種糖類、有機酸、維生素和各種無機鹽，對人體十分有益[2-3]，可以在常溫條件下放置幾個月都不產生霉爛等變化，因此，人們稱其為“天然水果罐頭”[4]。從《本草綱目》可知，柚子對于化痰止咳、食欲不振、消化不良等均有療效，且長時間吃柚子還可以美容養顏；柚子果肉及皮還含有生物活性物質生物苷[5]，可以降低血液黏稠度，減少血栓形成，對腦血管疾病如腦血栓、腦卒等也有較好的預防作用[6-8]。

柚子除了直接吃以外，還可以加工成生鮮面[9]、復合果汁[10]、果醬[11]、果脯[12]、果醋[13]和果酒[14]等，其果皮還可用來生產茶飲料[15]等。近年來，我國的柚子種植發展十分迅速，鮮果市場逐漸趨于飽和或過飽和狀態，對其進行深加工尋求新途徑以擴大柚果的產業鏈已成為亟待解決的問題[16]。

目前關于柚子釀酒、柚子酒發酵工藝條件優化的報道較少，因此，本研究以柚子為原料，在單因素試驗的基礎上，以酒精度為響應值，對柚子酒的發酵條件進行優化。為柚子酒的大規模生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

坪山柚：沃爾瑪超市；安琪高活性酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；亞硫酸、檸檬酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、FeSO4·7H2O、水楊酸、碳酸鈉（均為分析純）、雙氧水（30%）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA2204B型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；Q/GHSC型精密pH計：上海森信試驗儀器有限公司；WYT-J型手持式糖度儀：成都豪創光電儀器有限公司；D2KW-4型電熱恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；0-40型酒精計：國營河北省武強縣儀表廠；722型可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚子酒工藝流程與操作要點

原料預處理：柚子洗凈，去皮、去籽，將去籽柚子果肉放入榨汁機破碎。

酶解：在用榨汁機破碎后的柚子果肉漿中加入50 mg/L SO2以防止雜菌污染，加入40 mg/L果膠酶酶解24 h。

過濾：用滅過菌的三層紗布進行過濾，以除去大顆粒的果肉或粗纖維等。

成分調整：加入白砂糖調節糖度為220 g/L，加入檸檬酸調節酸度為4.5 g/L。

發酵：接入酵母菌0.08%，在一定溫度的恒溫培養箱中發酵14 d。

陳釀：在15℃條件下進行陳釀。

澄清過濾：按照0.1 g/100 mL果酒的添加量稱取皂土，將皂土在60℃的水中浸泡4 h，將浸泡后的皂土加入果酒中，澄清1 h，之后用硅藻土進行過濾，即得柚子酒成品。

1.3.2 柚子酒發酵條件優化單因素試驗

在其他條件不變的情況下，分別考察水∶柚子汁（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V））、SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）、酵母菌接種量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發酵溫度（20℃、24℃、28℃、32℃、36℃）對柚子酒酒精度的影響。

1.3.3 柚子酒發酵條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Design-Expert軟件中Box-Benhnken的設計原理，進行4因素3水平的響應面分析，以水∶柚子汁（X1）、SO2添加量（X2）、酵母菌接種量（X3）及發酵溫度（X4）為自變量，以酒精度（Y）為響應值，確定各因素對響應值的影響，確定發酵的最佳條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 柚子酒發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

可溶性固形物：用手持折光儀進行測定[17]；pH值：用pH計進行測定；比重：用比重計進行測定[18]；總酸：采用酸堿滴定法[19]；酒精度：采用蒸餾法[20]，用酒精計測量其酒精含量。

2 結果與分析

2.1 柚子酒發酵條件優化單因素試驗

2.1.1 水與柚子汁體積比對柚子酒酒精度的影響

由圖1可知，柚子酒酒精度隨水與柚子汁體積比的變化呈先升高后降低的趨勢，在水∶柚子汁為1∶1（V/V）時，酒精度達到最高值，為13%vol。可能是由于柚子汁中的某些物質的濃度會影響酵母菌的發酵，當濃度過低時使得發酵緩慢，而濃度過高時又會抑制酵母菌的生長代謝。因此，選擇水∶柚子汁為1∶1（V/V）。

圖1 水與柚子汁體積比對柚子酒酒精度的影響Fig.1 Effect of water to pomelo juice ratio on the alcohol content of pomelo wine

2.1.2 SO2添加量對柚子酒酒精度的影響

二氧化硫有殺菌、增酸、抗氧化等作用，可以使果酒變得澄清，并且使得果酒中色素和單寧物質更容易溶解出來，優化果酒的口感和風味。由圖2可知，隨著SO2添加量的增加，酒精度隨之增加，當SO2添加量為60 mg/L時，酒精度達到最大值，為12.0%vol，繼續增加SO2添加量，酒精度開始降低。因此，選擇SO2添加量60 mg/L。

圖2 SO2添加量對柚子酒酒精度的影響Fig.2 Effect of SO2addition on the alcohol content of pomelo wine

2.1.3 酵母菌接種量對柚子酒酒精度的影響

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的增加，酒精度隨之增加，當接種量為0.08%時，酒精度達到最大值，為11.8%vol，當接種量＞0.08%之后，酒精度反而開始降低。可能是因為酵母菌接種量較低時，發酵緩慢，酒精產生速率較低；隨著接種量的增加，發酵加快，此時酒精度迅速上升，當繼續增加接種量，酵母菌數量增加，酒中營養物質被大量消耗，代謝物堆積，不利于酵母菌生長，使發酵減慢，產酒精的速率減慢，所以隨著酵母菌接種量的增加，反而會出現酒精度降低的情況。因此，選擇酵母接種量為0.08%。

圖3 酵母菌接種量對柚子酒酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the alcohol content of pomelo wine

2.1.4 不同發酵溫度對柚子酒酒精度的影響

由圖4可知，酒精度隨著發酵溫度的升高而逐漸增加，當發酵溫度為28℃時，酒精度最高，為11.9%vol；當溫度超過28℃之后，酒精度隨溫度升高開始下降。溫度的高低會影響酵母菌的生理活性，溫度過低，酵母菌生長代謝緩慢，發酵緩慢，造成發酵時間的延長；溫度過高，不利于酵母菌的生長，影響發酵。因此，選擇發酵溫度為28℃。

圖4 發酵溫度對柚子酒酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine

2.2 柚子酒發酵條件優化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果與分析

表2 柚子酒發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization

續表

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，表明模型方程極其顯著，說明試驗方法可靠可行；失擬項P=0.067 8＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合度很好，試驗誤差很小，模型選擇恰當，能較好地反映出發酵工藝中各個因素和酒精度（Y）之間的真實關系，可用回歸方程預測最佳的發酵參數；模型的回歸決定系數R2=0.980 6，說明模型擬合程度很好，響應值的變化有98.06%來源于所選因素的變化，只有1.94%的變異不能用本模型解釋。一次項X1、X3、X4對Y有極顯著影響（P＜0.01），均為正效應；交互項X1X2對Y有極顯著影響（P＜0.01），為正效應；二次項X12、X22、X42對Y的影響極顯著（P＜0.01），均為負效應；X32對Y影響顯著（P＜0.05）；其余變量的影響均不顯著（P＞0.05）。

經回歸擬合后，得到回歸方程：

分別對二次回歸方程的X1、X2、X3、X4求導，得到柚子酒最優發酵條件：水與柚子汁混合比例為1∶1.3386，SO2添加量為60.87mg/L，酵母菌接種量為0.093%，發酵溫度為28.36℃。在此優化條件下，柚子酒酒精度理論值為13.45%vol。

2.2.2 柚子酒發酵工藝條件優化的響應面圖

由圖形的陡峭趨勢比較可得出各因素參數對響應值影響的大小以及最優參數，圖形曲面越陡峭，則說明其對響應值的影響越大。由圖5可知，當水與柚子汁體積比為1∶1、SO2添加量為60 mg/L時，酒精度最高，且水與柚汁混合比對響應值的影響大于SO2添加量；當水與柚子汁體積比為1∶1、酵母菌接種量為0.08%時，酒精度最高，水與柚子汁混合比對響應值的影響大于酵母菌接種量；當水與柚子汁體積比為1∶1、發酵溫度為28℃時，酒精度最高，可看出發酵溫度對響應值的影響大于水與柚子汁體積比；當SO2添加量為60 mg/L、酵母菌接種量為0.08%時，酒精度最高，且SO2添加量對響應值的影響大于酵母菌接種量；當SO2添加量為60 mg/L、發酵溫度為28℃時，酒精度最高，且發酵溫度對響應值的影響大于SO2添加量；酵母菌接種量為0.08%、發酵溫度為28℃時，酒精度最高，且發酵溫度對響應值的影響大于酵母菌接種量。

圖5 水與柚子汁體積比、SO2添加量、酵母菌接種量、發酵溫度交互作用對柚子酒酒精度影響的響應曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between water to pomelo juice ratio,SO2addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine

2.2.3 驗證試驗

為方便實際操作，修改發酵條件為水與柚子汁混合比例為1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接種量為0.09%，發酵溫度為28℃。在上述最佳工藝條件下重復柚子酒發酵3次，測得的平均酒精度為13.4%vol，與二階模型預測值13.45%vol基本一致，相對誤差很小，可見模型可以較好地預測出實際柚子酒發酵完成后酒精度的情況，基于響應面分析法優化柚子酒發酵工藝條件參數是可靠的。

3 結論

本試驗在單因素試驗的基礎上，以酒精度為響應值，進行4因素3水平響應面試驗，確定發酵的最佳條件為水與柚子汁體積比為1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接種量為0.09%，發酵溫度為28℃，在此優化條件下，柚子酒發酵酒精度為13.4%vol。