適于脫脂羊奶益生菌發酵劑發酵條件的優化

單 靜，閆澤文，鄭思凡，王 恒，姜竹茂*

（煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005）

益生菌是一種通過調節腸道菌群平衡而對寄主機體施加有利影響的活的微生物[1-3]。近年來已相繼提出了食用含益生菌產品的多種益處，包括抗菌、抗誘變、抗癌和降高血壓以及降低血清膽固醇的含量、減輕乳糖不耐癥等，同時還可以減少過敏現象的發生[4-8]。而要想達到這些健康效應，益生菌活菌數量是一個重要指標[9-11]。羊奶作為一種比較獨特且又營養豐富的乳品資源，含有200多種營養物質和生物活性物質，被稱為“奶中之王”[12-14]。隨著乳制品市場的不斷創新，多奶源、多種類將是未來乳業的發展趨勢，人們對羊奶制品需求也由最初的營養健康上升為保健功能，這無疑對羊奶發酵劑的質量及種類提出了新的要求。針對羊奶凝乳性差、益生菌存活率低、有特殊氣味等問題，AHMED M等[15]從羊奶中分離出19種乳酸菌，通過對其進行蛋白質水解、感官和安全性檢測，篩選出菌株LbMS16、LbMS21和LbMF25作為羊奶制品的發酵劑；李串娜[16]通過對保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的培養基進行優化，篩選出適宜的凍干保護劑，對酸羊奶直投式發酵劑進行了研究；葛萍等[17-18]通過對適于羊奶發酵的益生菌進行篩選后，與基礎發酵劑YO-MIX883復配制成活菌數高、黏度大的羊奶飲料發酵劑。目前羊奶發酵劑在酸羊奶加工方面的研究較多，但鮮見關于益生菌在脫脂羊奶發酵基質中生長特性的研究。因此，本研究以脫脂羊奶為發酵基質，篩選出適宜羊奶發酵的菌種，通過單因素及正交試驗優化發酵條件，將羊奶的營養功能和益生菌的保健功能有機結合，以期開發出一款產酸能力強和活菌數高的復配益生菌發酵劑，對益生菌羊奶飲料的開發具有較好的理論及實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）LC-01：丹麥科漢森有限公司；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）LAFTT-L10：帝斯曼（DSM）中國有限公司；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）LPc-G110、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Lp-G18：潤盈生物工程（上海）有限公司；長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）CICC6187：中國工業微生物菌種保藏管理中心；羊奶：煙臺某養殖場。

MRS固體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 6.2～6.6，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

CRJ-0.03/60型均質機：廊坊成瑞機械設備有限公司；FA1004型電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；EM-30型磁力攪拌水浴鍋：常州人和儀器廠；DNP-9082型電熱恒溫恒濕培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZM-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；9N100型碟式牛奶分離機：青海農牧機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊奶發酵劑的加工工藝流程

羊奶脫脂→均質（65℃、20 MPa）→熱處理（115℃、15 min）→冷卻（37℃左右）→接種→單菌培養→篩選→復配培養→發酵劑

1.3.2 羊奶發酵劑加工操作要點

（1）脫脂羊奶的制備

利用碟式牛奶分離機將羊奶進行脫脂處理，控制含脂率≤0.5%，因為羊奶中含有的游離脂肪酸會抑制益生菌的增殖，影響發酵劑菌種的培養及篩選。

（2）接種：稱取益生菌各1 g，分別投放于99 mL的滅菌脫脂羊奶中，搖勻，制成菌含量為1%的接種菌液，發酵接種量以接種的脫脂乳體積計算[19]。

（3）單菌培養：將干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌放置于37℃恒溫培養箱中培養72 h，長雙歧桿菌置于厭氧培養罐中再放入37℃恒溫培養箱中培養72h。

（4）篩選：選擇產酸能力強、活菌數高的菌種進行復配發酵篩選試驗。

（5）復配培養：根據菌株間的共生調節機制，將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、副干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌分別以2∶1復配，在37℃的恒溫條件下厭氧培養72 h，得發酵劑。

1.3.3 益生菌的篩選及復配試驗

（1）益生菌種類對脫脂羊奶發酵性能的影響

以滅菌脫脂羊奶為發酵基質，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、長雙歧桿菌為試驗對象，在預試驗的基礎上，以接種量為4%，發酵溫度為37℃，發酵時間為72 h的條件下，每隔6 h測定一次不同益生菌發酵液的酸度、pH值和活菌數[20]，對12組數據進行分析，篩選出產酸能力強、活菌數高的菌種進行復配發酵試驗研究。

（2）不同復配益生菌對脫脂羊奶發酵性能的影響

在單菌種發酵試驗菌種的基礎上，以及根據益生菌的共生調節機制，將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、副干酪乳桿菌與長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌分別以2∶1復配，接種量為4%，在37℃的恒溫條件下厭氧培養72h。試驗過程中每隔6 h測定一次不同復配菌種在生長穩定期（益生菌活菌數基本保持不變時）的最大活菌數，篩選出最佳益生菌組合。

（3）復配益生菌比例對脫脂羊奶發酵性能的影響

將干酪乳桿菌與長雙歧桿菌以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2（V/V）混合，按4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下培養至菌種生長穩定期，測定其發酵酸度和活菌數，確定最佳復配比例。

1.3.4 復配益生菌發酵條件優化單因素試驗

（1）接種量對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

復配益生菌按照2%、3%、4%、5%、6%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下發酵至益生菌生長穩定期，測定其發酵酸度和活菌數，確定復配益生菌的最佳接種量。

（2）發酵溫度對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

復配益生菌按照4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，分別在35℃、36℃、37℃、38℃、39℃條件下發酵至益生菌生長穩定期，測定其發酵酸度和活菌數，確定復配益生菌的最佳發酵溫度。

（3）發酵時間對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

復配益生菌按照4%的接種量接入滅菌后的脫脂羊奶中，在37℃條件下發酵至菌種生長衰亡期（益生菌活菌數逐漸降低時），每隔6 h測定一次發酵酸度和活菌數，確定復配益生菌的最佳發酵時間。

1.3.5 復配益生菌發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）進行3因素3水平的正交試驗，以益生菌活菌數為評價指標，通過正交試驗優化得出最佳發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 復配益生菌發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of compound probiotics

1.3.6 分析檢測

酸度的測定參照GB5009.239—2016《食品酸度的測定》中酚酞指示劑法；pH值的測定用pH計測量3次，取其平均值；益生菌活菌數的測定參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中MRS平板計數法。

1.3.7 數據處理

數據采用Origin 8.0.5統計分析軟件進行處理，采用SPSS20.0進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 益生菌種類對脫脂羊奶發酵性能的影響

圖1 單菌發酵滴定酸度和pH值（A）與活菌數（B）隨時間變化曲線Fig.1 Change curves of titration acidity,pH(A)and viable bacteria count(B)during single bacterium fermentation process

在脫脂羊奶發酵過程中，不同益生菌產酸能力及生長曲線均有一定的差別，這不僅與益生菌本身的發酵特性有關，也與其發酵介質有關[21]。由圖1可知，干酪乳桿菌在生長穩定期最高活菌數達到6.19×108CFU/mL，顯著高于其他幾組菌（P＜0.05），雖然在發酵后期活菌總數下降，但是發酵基質中的乳糖還沒有消耗完，益生菌仍可以利用其作為能量來源物質生成乳酸[22]。因此，活菌基數越大，活菌下降速度越慢，產生的乳酸也就越多，滴定酸度也越高。5種菌種產酸能力最大的是干酪乳桿菌，發酵終點時滴定酸度達到（194.26±0.89）°T，而副干酪乳桿菌為（185.53±1.03）°T，嗜酸乳桿菌為（172.59±0.79）°T，植物乳桿菌為（148.18±0.51）°T，長雙歧桿菌為（161.54±0.94）°T。而嗜酸乳桿菌在發酵初期，產酸速度較快，明顯高于其他4種菌。并且滴定酸度要滯后于pH值，主要由于pH值的大小不僅取決于酸的數量和性質，而且還受到發酵基質中緩沖物質的影響[23]。此外，5種益生菌在發酵48h之后產酸量逐漸趨向平穩。結果表明，干酪乳桿菌在發酵初期產酸速度相對較慢，但是其產酸周期最長，產酸能力最強，生長穩定期的活菌數最高。

2.2 復配益生菌對脫脂羊奶發酵性能的影響

復配益生菌對脫脂羊奶中活菌數的影響結果見圖2。由圖2可知，各復配菌種在穩定期的最大活菌數差異較大。并且復配菌種的最大活菌數要明顯高于其單菌種發酵的最大活菌數，所以當復配菌種存在共生機制時可以提高發酵基質中的活菌數，進而提高發酵效率[17]。其中干酪乳桿菌和長雙歧桿菌在3種復配益生菌組合中的增菌效果最好，在生長穩定期的最大活菌數為8.89×108CFU/mL。雖然嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）混合發酵時，較其他2組菌最先達到生長穩定期，但其復配組合的增菌效果（8.26×108CFU/mL）以及到達穩定期的時間明顯低于干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）。因為較高的活菌數和適宜的發酵時間有利于后期加工過程中獲得足夠的發酵酸度、風味物質以及提高產品的穩定性。副干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）與干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）復配組合具有相似的生長趨勢，但增菌效果顯著低于其他2組（P＜0.05）。此外，干酪乳桿菌和長雙歧桿菌（2∶1）復配組合的最大活菌數與葛萍[17]研究的副干酪乳桿菌（LP01）和YO-MIX883組合相比高近40%，可能與發酵基質的成分或菌種特性有關。因此，選擇干酪乳桿菌和長雙歧桿菌混合菌發酵脫脂羊奶較為合適。

圖2 復配益生菌活菌數隨時間變化曲線Fig.2 Change curve of viable compound probiotics count with time

2.3 益生菌復配比例對脫脂羊奶發酵性能的影響

益生菌復配比例對脫脂羊奶發酵性能的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著干酪乳桿菌與長雙歧桿菌接種比例的減小，發酵基質中的活菌數呈現先升高后降低的趨勢，表明了干酪乳桿菌與長雙歧桿菌存在良好的共生關系，適當接種長雙歧桿菌有利于增加發酵基質中的活菌數，提高發酵效率以及縮短發酵凝乳時間。滴定酸度隨著接種比例的變化呈現逐漸降低的趨勢，由于干酪乳桿菌的產酸能力優于長雙歧桿菌，因此，隨著干酪乳桿菌接種比例的減小，滴定酸度隨之降低。綜合考慮益生菌的活菌數和產酸能力，因此選擇干酪乳桿菌和長雙歧桿菌的最佳復配比為3∶1。

圖3 干酪乳桿菌和長雙歧桿菌接種比例對益生菌活菌數和滴定酸度的影響Fig.3 Effect ofLactobacillus caseiandBifidobacterium longum inoculation ratio on viable probiotics count and titration acidity

2.4 復配益生菌發酵劑發酵條件優化單因素試驗

2.4.1 接種量對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

接種量對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響結果見表2。在發酵過程中發酵劑接種量會直接影響發酵基質中益生菌的存活率。當發酵劑接種量較少時，發酵速度緩慢。而當發酵劑接種量過大時，菌種產酸速度加快，并隨著發酵的進行，菌種由穩定期進入衰亡期，菌體易出現自溶現象，再加上酸度對菌體的抑制作用隨著酸度的增大越發明顯[24-25]，致使益生菌活菌數呈現下降的趨勢。菌種的發酵性能除了受外部生長環境的影響，還與自身生理特性有關，從而抑制益生菌的生長繁殖，使發酵基質中活菌數降低。由表2可知，隨著益生菌接種量增加，滴定酸度逐漸增大，并且pH值隨之降低。其中當接種量為4%時，脫脂羊奶基質中益生菌在穩定期的最大活菌數最高，并且顯著高于接種量為2%、3%、5%和6%（P＜0.05），考慮生產成本的節約及較高的活菌數發酵條件，選擇復配益生菌發酵劑的接種量4%為最佳。

表2 接種量對發酵劑發酵性能的影響Table 2 Effect of inoculum on fermentation performance of starter

2.4.2 發酵時間對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

發酵時間對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著發酵時間的延長，發酵基質中的滴定酸度和益生菌活菌數都有逐漸增大趨勢，而發酵后期，酸度趨于平穩狀態，益生菌活菌數由于受到發酵基質環境的影響呈現下降的趨勢。在發酵時間為48～54 h時，發酵基質中益生菌活菌數達到最大，顯著高于其他發酵時間。在發酵初期，菌種處于適應期，生長速度緩慢，隨后菌體進入對數期，生長繁殖較快，發酵基質中活菌數増加，隨著發酵時間的延長，益生菌分解乳糖產生乳酸，使發酵基質的滴定酸度升高，從而抑制了菌種自身的生長，造成活菌數的下降。因此，選擇54 h為最佳發酵時間。

圖4 發酵時間對發酵劑滴定酸度及活菌數的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the titration acidity and viable probiotics count of starter

2.4.3 發酵溫度對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響

發酵溫度對復配益生菌發酵劑發酵性能的影響結果見表3。由表3可知，隨著發酵溫度的升高，發酵基質中酸度和活菌數變化顯著（P＜0.05），而pH變化不顯著（P＞0.05）。當復配發酵劑在37℃發酵時，發酵基質中益生菌活菌數明顯高于其他幾組。由于發酵溫度與菌種代謝活動密切相關，在最適溫度下代謝旺盛，菌體生長較快。并且不同的菌種有其適宜生長溫度，在此溫度下發酵基質中益生菌活菌數較高，同時也具有較強的耐酸性，能夠抵抗發酵過程中乳酸的影響。因此，從益生菌發酵方面來看，復配益生菌發酵劑在37℃條件下發酵有利于益生菌的生長繁殖。

表3 發酵溫度對發酵劑發酵性能的影響Table 3 Effect of fermentation temperature on fermentation performance of starter

2.5 復配益生菌發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以益生菌活菌數為考察指標，選擇接種量、發酵時間、發酵溫度為影響因素進行3因素3水平的正交試驗，其結果與分析見表4。

表4 復配益生菌發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition optimization of compound probiotics

由表4可知，極差R越大，表示該因素對指標的影響越大，因此，各因素對復配益生菌活菌數的影響大小為發酵時間＞接種量＞發酵溫度，最優發酵條件組合為A2B2C2，即接種量4%，發酵時間為54 h，發酵溫度為37℃。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，益生菌的最大活菌數為9.59×108CFU/mL，滴定酸度為198.56 °T。

3 結論

在脫脂羊奶為發酵基質的基礎上，通過探究干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌等單菌的最大活菌數和產酸能力，并根據菌種間的共生調節機制，篩選出適于脫脂羊奶發酵的復配益生菌組合。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗進一步對復配益生菌發酵劑的最佳發酵條件進行優化，即復配益生菌組合為干酪乳桿菌和長雙歧桿菌，復配比為3∶1，接種量為4%，發酵時間54 h，發酵溫度37℃。在此優化發酵條件下，最大活菌數可達9.59×108CFU/mL，酸度為198.56°T，與其他適用于羊奶發酵劑的發酵性能相比，干酪乳桿菌和長雙歧桿菌復配組合可以賦予羊奶基質足夠的發酵酸度、風味物質和活菌數，為益生菌羊奶飲料的開發奠定了良好的實踐意義。