枸杞內(nèi)生酵母菌的篩選及其發(fā)酵特性研究

李亞輝，梁 穎，王 英，周劍忠*，蒲 青，趙慧芳

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；3.青海昆侖河枸杞有限公司，青海 海西州 816102；4.樂享世紀（天津）科技有限公司，天津 100199）

枸杞（Lycium sinensisMill）為茄科落葉灌木，在全球共有97個品種，其中有31種已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域[1]。中國枸杞主要分布在西北地區(qū)，如寧夏和柴達木盆地，其中柴達木枸杞已占該地區(qū)農(nóng)牧業(yè)總產(chǎn)值的50.4%[2-3]。枸杞含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分（如枸杞多糖、甜菜堿、氨基酸、胡蘿卜素、尼克酸和微量元素等），具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、補肝益腎、降血脂和降血糖等功效，是一種良好的“藥食同源”食品[4-6]。

枸杞作為藥食兩用性植物深受人們青睞，但其商品形式比較單一，商業(yè)價值有待被挖掘。新鮮枸杞水分和糖含量高，不易儲存、保質(zhì)期短，目前主要進行干制品加工[7]。以枸杞鮮果為原料開發(fā)產(chǎn)品，具有減少資源浪費、有效保留營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)等優(yōu)點。新鮮枸杞汁液豐富、顏色深厚、果香濃郁，且具有較高的營養(yǎng)和保健功能，是釀造保健型果酒的良好原料[8]。加工釀造枸杞酒不僅可最大限度保留原料中的營養(yǎng)成分，而且通過生物發(fā)酵還可產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)和保健功能因子，是提高枸杞附加值的重要途徑[9-10]。目前枸杞果酒已在市場上出現(xiàn)，但其發(fā)酵技術(shù)主要參照葡萄酒的釀造工藝，其品質(zhì)還有待提高[11]。酵母對發(fā)酵過程及果酒品質(zhì)至關(guān)重要，目前枸杞酒的釀造主要采用葡萄酒釀造商業(yè)化酵母，不能完全體現(xiàn)出枸杞獨特的風(fēng)味[12]。因此，篩選枸杞專用釀酒酵母是提高枸杞酒整體品質(zhì)的重要途徑。

本研究以青海海西州都蘭縣（柴達木盆地）新鮮枸杞為原料，通過自然發(fā)酵分離出枸杞內(nèi)生酵母，并對其發(fā)酵特性進行研究，以期篩選出具有良好發(fā)酵性能的枸杞專用釀酒酵母，改善枸杞酒風(fēng)味，提高枸杞酒品質(zhì)，為枸杞酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持，促進枸杞產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮枸杞：青海海西州都蘭縣青海昆侖河枸杞有限公司。

果膠酶（4萬U/g）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：上海杰兔工貿(mào)有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母浸膏、蛋白胨（均為生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酚酞、蒽酮（均為分析純）：上海浦口化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PSH-300生化培養(yǎng)箱：中科生命科技股份有限公司；SJ-CJ-2FQ潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-200電熱干燥培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩機：太倉市實驗設(shè)備廠；XSP-4C顯微鏡：上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器廠；SevenEasy plus pH儀：梅特勒-托利多儀器上海股份有限公司；723型可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞酒自然發(fā)酵工藝流程及操作要點

操作要點：選擇無腐爛、無雜質(zhì)的新鮮枸杞，打漿后，立即加入0.01%偏重亞硫酸鉀（相當(dāng)于0.005%的二氧化硫），攪拌均勻。然后加入0.3%果膠酶，35℃酶解2～3 h，再按質(zhì)量比加入10%的蔗糖，攪拌均勻，25℃條件下恒溫發(fā)酵。當(dāng)糖含量降低約13%時，取樣分離酵母，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時發(fā)酵結(jié)束，立即分離，常溫自然澄清2周后，用硅藻土下膠，-2℃條件下處理一周，采用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾、灌裝。

1.3.2 酵母菌的分離

當(dāng)枸杞發(fā)酵液中糖含量降低約13%時，取樣，然后按照湯衛(wèi)華等[13-14]的方法分離酵母：取發(fā)酵液100 μL，采用10倍梯度稀釋法稀釋至10-4～10-9，分別吸取0.5 mL稀釋液轉(zhuǎn)入YPD固體平板培養(yǎng)基，涂布均勻，于28℃培養(yǎng)48 h，挑選光滑的單菌落10個，在YPD固體平板上劃線并于28℃培養(yǎng)48 h，再次挑選單菌落在試管斜面上劃線，于28℃培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酵母菌的篩選

通過分離酵母菌形態(tài)的觀察、產(chǎn)氣性能、產(chǎn)酒精力及發(fā)酵力的測定，篩選優(yōu)良酵母。

形態(tài)觀察：挑取斜面上的單菌落劃線于YPD平板，28℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落的質(zhì)地、顏色和表面特征。挑選表面光滑、球形、不透明、奶油狀的單菌落進行鏡檢，觀察并記錄細胞形態(tài)、繁殖方式等。

產(chǎn)氣性能測定：采用杜氏管發(fā)酵法[15]測定初步篩選出的酵母菌的產(chǎn)氣能力，記錄產(chǎn)氣時間和產(chǎn)氣量，重復(fù)測定3次。

產(chǎn)酒精力測定：參照牛廣財?shù)萚16]的方法。按照接種量1×107CFU/mL將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基，28℃、100 r/min條件下發(fā)酵8 d，測定發(fā)酵液的酒精度并由感官評定小組對發(fā)酵液的酒香和發(fā)酵香氣進行感官評定，重復(fù)測定3次。

發(fā)酵力測定：采用CO2失重法[16]測定初篩酵母菌的發(fā)酵能力。按接種量1×107CFU/mL將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基，28℃、100 r/min條件下培養(yǎng)8 d，每隔12 h測定1次質(zhì)量，重復(fù)測定3次。以發(fā)酵時間（x）為橫坐標(biāo)，CO2質(zhì)量損失（y）為縱坐標(biāo)，繪制發(fā)酵力曲線。

1.3.4 酵母菌耐受性的測定

參照王榮榮等[17]的方法對篩選酵母菌的耐受性進行測定。調(diào)整YPD培養(yǎng)基的葡萄糖含量（200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L），乙醇含量（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol）和SO2含量（150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L），按5%（0.6×106CFU/mL）的接種量接種篩選酵母菌株，于28℃、100r/min條件下發(fā)酵48h，分別以葡萄糖質(zhì)量濃度為20g/L、不添加乙醇、不添加SO2為對照，采用血球計數(shù)板測定發(fā)酵液中的菌體數(shù)，每組3個平行。

1.3.5 理化指標(biāo)測定及感官評定

按照方法1.3.1工藝流程，向枸杞汁中添加8%蔗糖，接種優(yōu)良酵母，28℃條件下恒溫發(fā)酵，每天攪拌一次并測定殘?zhí)橇?，?dāng)發(fā)酵液殘?zhí)橇浚? g/L時，記錄發(fā)酵時間并取樣。參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發(fā)酵液的總酸、總糖、總SO2含量、游離SO2含量、pH值和酒精度。參照周書來等[18]的方法對產(chǎn)品進行感官評定，感官評定由8位經(jīng)驗豐富、具有專業(yè)知識的人員組成感官評定小組。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞酒自然發(fā)酵酵母菌的分離

當(dāng)枸杞發(fā)酵液中糖含量降低約13%時，取樣分離酵母，從稀釋度為10-8平板上挑選10個光滑的單菌落進行平板劃線，分離得到10株菌株，編號為G1～G10，其中菌株G1、G3和G8的平板劃線結(jié)果如圖1所示。

圖1 分離菌株平板劃線結(jié)果Fig.1 Plate streaking results of isolated strains

由圖1可知，菌株G1、G3和G8菌落形態(tài)較大，圓形、有突起，顏色為乳白色，且表面光滑，符合酵母菌的菌落特征。

2.2 枸杞酒自然發(fā)酵酵母的篩選

2.2.1 形態(tài)觀察

分離菌株G1～G10的細胞形態(tài)和菌落形態(tài)見圖2和表1。

圖2 分離酵母菌的細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of isolated yeasts

表1 分離菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of isolated strains

由圖2和表1可知，菌株G1、G2、G3、G4、G8和G9的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)基本一致，菌落為圓形、突起、白色或乳白色、光滑、有酒香味，細胞為圓形或橢圓、出芽生殖，符合酵母菌特征。菌株G5的菌落形態(tài)為圓形、扁平、淡黃色且無酒香味，細胞為橢圓形、無芽體；菌株G6的菌落形態(tài)為圓形、扁平、白色且無酒香味，細胞為長桿形、無芽體；菌株G7和G10的菌落形態(tài)為圓形、扁平、淡黃色或白色且無酒香味，細胞為橢圓、有芽體。根據(jù)菌落和細胞形態(tài)特征初步篩選出菌株G1、G2、G3、G4、G8和G9為酵母菌[13-14]。

2.2.2 產(chǎn)氣性能測定

對獲得的6株酵母菌G1、G2、G3、G4、G8和G9進行產(chǎn)氣性能測定，結(jié)果見表2。

表2 6株酵母菌的產(chǎn)氣性能測定結(jié)果Table 2 Determination results of gas-producing performance for 6 yeasts

由表2可知，28℃條件下發(fā)酵12 h時，菌株G2、G4和G9的產(chǎn)氣量為杜氏管體積的1/3，菌株G1、G3和G8產(chǎn)氣量為杜氏管體積的2/3；發(fā)酵24 h時，菌株G2和G9的產(chǎn)氣量為杜氏管體積的2/3，其余4株酵母菌的產(chǎn)氣量為杜氏管滿體積，結(jié)果表明，酵母菌G1、G3、G4和G8具有較強的產(chǎn)氣能力。

2.2.3 產(chǎn)酒精力測定

對6株酵母菌的產(chǎn)酒精力進行測定，并在培養(yǎng)后進行香氣感官評定，結(jié)果見表3。

表3 6株酵母菌的產(chǎn)酒精力和香氣評定結(jié)果Table 3 Results of liquor-producing capacity and aroma evaluation for 6 yeasts

由表3可知，菌株G1、G4和G8具有強的產(chǎn)酒精能力，發(fā)酵液的酒精度分別為10.4%vol、10.2%vol、10.8%vol，其次為菌株G3（9.8%vol），菌株G2和G9的產(chǎn)酒精力較差，發(fā)酵液的酒精度分別為6.5%vol、7.4%vol。菌株G1、G3和G8發(fā)酵后均具有典型的發(fā)酵果香和酒香，菌株G4香氣一般。結(jié)果說明，菌株G1和G8不僅具有較強的產(chǎn)酒精能力，且發(fā)酵后還產(chǎn)生較好的酒香和果香。

2.2.4 發(fā)酵力測定

對產(chǎn)氣能力和產(chǎn)酒精能力較強的菌株G1、G3、G4和G8進行發(fā)酵力測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，菌株G1和G8的CO2產(chǎn)生量明顯高于菌株G3和G4；菌株G1在發(fā)酵前3 d產(chǎn)生的CO2較高，為發(fā)酵旺盛期，發(fā)酵第48小時時，CO2產(chǎn)生量最大，CO2質(zhì)量損失為3.1 g），然后隨著發(fā)酵時間的延長，CO2產(chǎn)生量逐漸下降；菌株G8在發(fā)酵前4 d，CO2產(chǎn)生量較大，為發(fā)酵旺盛期，發(fā)酵第36小時時，CO2產(chǎn)生量最大，CO2質(zhì)量損失為3.3 g，然后隨著發(fā)酵時間的延長，CO2產(chǎn)生量逐漸下降。結(jié)果說明，菌株G1和G8具有較強的發(fā)酵能力，且明顯高于菌株G3和G4。

圖3 酵母菌G1、G3、G4和G8的發(fā)酵力曲線Fig.3 Fermentation capacity curves of yeast G1,G3,G4 and G8

通過形態(tài)觀察、產(chǎn)氣性能、產(chǎn)酒精力和發(fā)酵力的測定，篩選出菌株G1和G8為發(fā)酵性能良好的酵母菌，并對這兩株酵母菌的耐受性進行研究。

2.3 酵母菌耐受性的測定

2.3.1 SO2耐受性測定

酵母菌G1和G8的SO2耐受性測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同SO2含量對篩選酵母生長的影響Fig.4 Effect of different SO2content on growth of isolated yeasts

由圖4可知，隨著SO2含量的增加，菌株G1和G8的菌體數(shù)逐漸降低；當(dāng)SO2含量≤200mg/L時，SO2含量對兩株酵母菌的生長幾乎無影響（P＞0.05）；當(dāng)SO2含量為250 mg/L時，SO2含量對兩株菌的生長有顯著影響（P＜0.05）；當(dāng)SO2含量為300 mg/L時，SO2含量對兩株菌的生長有極顯著影響（P＜0.01）；當(dāng)SO2含量在250～350 mg/L范圍內(nèi)時，菌株G8對SO2的耐受性較菌株G1好。結(jié)果表明，菌株G1和G8最高可耐受250mg/L的SO2。通常情況下，果酒釀造中SO2含量＜200 mg/L[19]，因此，在SO2耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

2.3.2 乙醇耐受性測定

酵母菌G1和G8的乙醇耐受性測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同乙醇含量對篩選酵母生長的影響Fig.5 Effect of different content of ethanol on growth of isolated yeasts

由圖5可知，隨著乙醇含量的增加，菌株G1和G8的菌體數(shù)逐漸降低，當(dāng)乙醇含量為10%vol～14%vol時，對兩株菌的生長影響較?。≒＞0.05）；菌株G8在乙醇含量為16%vol時，菌體數(shù)明顯下降，而菌株G1在乙醇含量為18%vol時明顯下降；在不同乙醇含量下菌株G1對乙醇的耐受性較菌株G8好，在高乙醇含量下尤其明顯。結(jié)果表明，菌株G1的乙醇耐受性優(yōu)于菌株G8，菌株G1最高可耐受16%vol乙醇，菌株G8最高可耐受14%vol乙醇。通常情況下，果酒的酒精度≤12%vol[19]，因此，在乙醇耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

2.3.3 糖耐受性測定

酵母菌G1和G8的糖耐受性測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同糖含量對篩選酵母生長的影響Fig.6 Effect of different sugar content on growth of isolated yeasts

由圖6可知，隨著糖含量的增加，菌株G1和G8的菌體數(shù)逐漸降低，當(dāng)糖含量≤250 g/L時，對兩株菌的生長影響較?。≒＞0.05%）；當(dāng)糖含量為300 g/L時，對菌株G1的生長有明顯抑制作用（P＜0.05），而菌株G8在糖含量為350 g/L時，菌體數(shù)明顯下降（P＜0.05）；在不同糖含量下菌株G8對糖的耐受性優(yōu)于菌株G1，在高糖含量下尤其明顯。結(jié)果表明，菌株G8的糖耐受性優(yōu)于菌株G1，菌株G1最高可耐受250g/L的糖，菌株G8最高可耐受300g/L的糖。通常情況下，發(fā)酵液中糖含量≤250 g/L[20]，因此，在糖耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

耐受性測定結(jié)果表明，酵母菌G1和G8有較好的SO2、乙醇和糖耐受性，完全可以滿足枸杞酒發(fā)酵釀造的要求。

2.4 篩選酵母發(fā)酵枸杞酒的測定

分別接種菌株G1和G8于枸杞果汁中進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后檢測枸杞酒的總糖、總酸含量、酒精度、游離SO2含量及總SO2含量，并進行感官評價，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，與菌株G1發(fā)酵的枸杞酒相比，菌株G8發(fā)酵枸杞酒的發(fā)酵時間（7 d）短，總酸含量（10.3 g/L）少，酒精度（12.1%vol）高；兩株酵母菌發(fā)酵的枸杞酒的總糖含量、SO2含量和pH值差別不大（P＞0.05%）。菌株G8發(fā)酵的枸杞酒色、香、澄清度和口感均較好，而菌株G1發(fā)酵的枸杞酒無枸杞典型風(fēng)味，且稍有苦味和雜味。結(jié)果表明，菌株G8的發(fā)酵性能優(yōu)于菌株G1的發(fā)酵特性。

表4 篩選酵母發(fā)酵枸杞酒的測定結(jié)果Table 4 Determination results of wolfberry wine fermented by isolated yeasts

3 結(jié)論

本試驗從新鮮枸杞自然發(fā)酵液中篩選枸杞內(nèi)生釀酒酵母菌，并對其發(fā)酵特性進行研究。通過菌落形態(tài)和細胞形態(tài)觀察，從分離的10株菌中篩選出6株酵母菌，編號為G1、G2、G3、G4、G8和G9；通過產(chǎn)氣性能、產(chǎn)酒精力和發(fā)酵力測定，篩選出菌株G1和G8為性能良好的酵母菌。耐受性測定結(jié)果表明，菌株G1和G8有較好的SO2耐受性、乙醇耐受性和糖耐受性，均可耐受250 mg/L SO2，分別可耐受乙醇含量16%vol、14%vol，耐受糖含量250 g/L、300 g/L，完全可以滿足枸杞酒發(fā)酵釀造的要求；發(fā)酵指標(biāo)測定結(jié)果顯示，菌株G8發(fā)酵時間短（7 d）、發(fā)酵酒精度高（12.1%vol）、總酸含量低（10.3 g/L），發(fā)酵的枸杞酒香氣濃郁、具有枸杞典型風(fēng)味，發(fā)酵性能優(yōu)于G1。G8為篩選出的發(fā)酵性能優(yōu)良的枸杞內(nèi)生釀酒酵母。本研究對優(yōu)化枸杞酒發(fā)酵工藝、改善枸杞酒風(fēng)味，提高枸杞酒品質(zhì)具有重要意義。