海洋低溫葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉春瑩，王一茜，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

海洋占地球表面積約71%，由于特殊的生存環(huán)境，海洋微生物能產(chǎn)生陸棲微生物所不能產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、作用特殊的生物活性物質(zhì)，有較大的潛力應(yīng)用于醫(yī)療、食品、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域[1-2]，因此開(kāi)發(fā)具有全新性質(zhì)的酶已成為國(guó)際酶制劑研究的熱點(diǎn)[3]。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）EC l.1.3.4在氧氣存在的條件下能夠催化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，具有去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用[4-5]。1999年我國(guó)農(nóng)業(yè)部將GOD定為12種允許使用的飼料酶制劑添加劑之一，是十分重要的工業(yè)酶之一[6-7]。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國(guó)對(duì)GOD的需求量逐年上升，但我國(guó)GOD主要依賴進(jìn)口。GOD具有去除飼料中霉菌毒素、延長(zhǎng)飼料保質(zhì)期、提高飼料養(yǎng)分消化率和替代抗生素等作用，可調(diào)節(jié)畜禽腸道pH、保護(hù)腸道上皮細(xì)胞完整、減少應(yīng)激損傷、促進(jìn)生長(zhǎng)、降低死亡率等性能[8-11]，已成為研究學(xué)者和養(yǎng)殖企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。

黃曉月等[12]通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)GOD的海洋細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明，該菌的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31℃、接種量8%、轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間60 h，酶活為優(yōu)化前的1.5倍。郭云瑕等[13]通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)經(jīng)過(guò)紫外誘變后的黑曲霉進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵溫度30℃、接種量5%、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h為產(chǎn)GOD的最優(yōu)發(fā)酵條件，酶活為優(yōu)化前的9.56倍。HAQIU等[14]對(duì)紫外誘變后的黑曲霉進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活約為之前的2倍。范新蕾等[15]通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)GOD的黑曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活為優(yōu)化前的1.93倍。

GOD在動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)均有廣泛地分布[16]。國(guó)內(nèi)外GOD的來(lái)源主要為陸地來(lái)源的多為霉菌及其工程菌的生產(chǎn)菌株[17]，其培養(yǎng)溫度大多為30～40℃[18]，分離純化困難，生產(chǎn)成本高且無(wú)法直接應(yīng)用于食品領(lǐng)域。酵母菌具有安全性高、易培養(yǎng)、易于純化，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)[19]，但酵母菌源的GOD的研究近乎空白。因此從海洋中篩選出產(chǎn)低溫GOD的酵母菌，對(duì)擴(kuò)充資源庫(kù)具有重要意義。本研究以大連黃海海域海泥為樣本進(jìn)行海洋低溫酵母菌的篩選，并對(duì)其發(fā)酵條件（碳源及濃度，有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源及濃度，初始pH及發(fā)酵溫度等進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)研究，為實(shí)現(xiàn)低溫GOD的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品和試劑

海泥：大連黃海海域（123.396°E，36.7014°N，深度6～20 m）；蛋白Marker：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；鄰聯(lián)茴香胺：美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（60 U/mL）：生工生物工程（上海）股份有限公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：大連TaKaRa公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集（種子）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，海水配制，pH自然；121℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，蛋白胨3g/L，NaNO34g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，CaCO33.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，KI 1.7 g/L，脫氧膽酸鈉0.2 g/L，瓊脂 20 g/L，海水配制，pH 5.6；121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO34 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，CaCO310 g/L，海水配制，pH 5.6；121℃滅菌20 min。

菌種保藏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10g/L，瓊脂20g/L，海水配制，pH自然；121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HD-1360超凈工作臺(tái)：北京悅泰行科技發(fā)展有限公司；THZ-312臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精勝科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；BZ-01顯微鏡：德國(guó)徠卡公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMO FISHER公司；pHB-4p酸度計(jì)：上海升隆電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)低溫GOD酵母菌的分離篩選

取1 g海泥樣品在無(wú)菌操作條件下加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，25℃、160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。

用無(wú)菌海水將富集培養(yǎng)液從10-1依次稀釋至10-6，分別吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)梯度稀釋液200 μL均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。挑取菌落周?chē)霈F(xiàn)藍(lán)紫圈的酵母菌株，接種到新的初篩培養(yǎng)基平板中劃線純化培養(yǎng)。

將純化好的具有藍(lán)紫圈的酵母菌株接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于25℃、160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取1 mL發(fā)酵液，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清即為粗酶液，測(cè)定GOD酶活力。

1.3.2 GOD酶活測(cè)定方法

葡萄糖氧化酶酶活的定義：在下述條件下，每1分鐘將1 μmol的β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸并生成過(guò)氧化氫所需的酶量為1個(gè)單位（U/mL）。

反應(yīng)底物為100 μL 5%葡萄糖溶液、200 μL 0.07 g/L鄰聯(lián)茴香胺溶液、10 μL 0.1 g/L辣根過(guò)氧化物酶溶液的混合溶液[20-23]。將底物與10 μL GOD標(biāo)準(zhǔn)樣品或粗酶液分別于25℃溫育10min，然后將底物與酶液迅速混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)其在波長(zhǎng)500 nm條件下測(cè)其吸光度值的變化值，每隔1 min測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定5 min。計(jì)算每分鐘吸光度值增加值的平均值ΔA。GOD酶活計(jì)算公式如下：

式中：EAGOD為葡萄糖氧化酶酶活，U/mL；ΔA：吸光度值的變化值；V1為反應(yīng)液體積，mL；V2為樣品體積，mL；7.5為消光系數(shù)。

1.3.3 菌種保藏

斜面保藏：將篩選到的具有產(chǎn)GOD能力的酵母菌株分別接種到斜面保藏培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

甘油保藏：將篩選到的具有產(chǎn)GOD能力的酵母菌株分別接種到種子培養(yǎng)基上，25℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液與滅菌過(guò)的甘油混合，甘油終濃度為25%，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 菌株鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的產(chǎn)GOD酵母菌接種于固體培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)學(xué)特征，并在光學(xué)顯微鏡（10×100）及電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

（2）分子生物學(xué)鑒定

采用真菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，然后采用通用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序。將得到的菌株DNA序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并下載相似性最大的序列和該屬內(nèi)代表種，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[24-25]。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)源的種類及濃度對(duì)產(chǎn)酶均有不同程度的影響，選擇合適的營(yíng)養(yǎng)源及其濃度可提高菌株產(chǎn)GOD的酶活。以GOD的酶活為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化擔(dān)子菌WYQ 23的最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

單因素試驗(yàn)：分別對(duì)碳源種類（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖）及添加量（2%、4%、6%、8%、10%）進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)有機(jī)氮源種類（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、玉米膏）及添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)無(wú)機(jī)氮源種類（NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3）及添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)無(wú)機(jī)鹽（KH2PO4、MgSO4、KCl、CaCO3）添加量分別進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）和發(fā)酵溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）進(jìn)行優(yōu)化，所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行。

正交試驗(yàn)：在培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以菌體產(chǎn)葡萄糖氧化酶的酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、NaNO3（C）添加量及發(fā)酵溫度（D）為影響因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶條件，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme production condition optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)低溫GOD酵母菌篩選

從海泥樣品中共分離到26株酵母菌，根據(jù)菌落形態(tài)及是否有藍(lán)紫圈最終獲得5株不同酵母菌。將這5株酵母菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定其酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，通過(guò)比較其酶活力，從中篩選出一株酶活最高的菌株WYQ23，該菌株酶活為0.66U/mL，其他菌株酶活為0.17～0.53U/mL。

表2 產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶菌株的篩選結(jié)果Table 2 Screening results of low temperature glucose oxidase producing strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株WYQ 23在固體種子培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)生長(zhǎng)，3～7 d后得到直徑約為4～10 mm的褐色的菌落。由圖1A可知，菌落呈圓形，扁平，較不透明，表面較光滑，正面與反面以及邊緣與中央部位的顏色較一致。由圖1B可知，菌株顯微鏡下呈卵圓形，與酵母菌鏡下形態(tài)一致。

圖1 菌株WYQ 23的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain WYQ 23

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株WYQ 23的ITS區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，經(jīng)比對(duì)，該菌株與Basidioascussp.相似度最高，達(dá)99%。因此，該菌株被鑒定為擔(dān)子菌（Basidioascussp.）。該菌株ITS區(qū)序列已申請(qǐng)GenBank號(hào)，為SUB4615397 Seq1 MK038973。

圖2 菌株WYQ 23基于ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain WYQ 23 based on ITS gene sequences

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響

分別以6%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源，培養(yǎng)菌株WYQ 23，培養(yǎng)基中其他成分及含量均與發(fā)酵培養(yǎng)基一致。發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)其酶活，結(jié)果如圖3A所示。由圖3A可知，當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)酶活最高，為0.66U/mL，蔗糖次之，為0.61 U/mL，當(dāng)麥芽糖和乳糖為碳源時(shí)的酶活較低，當(dāng)可溶性淀粉為碳源時(shí)酶活極低。因此菌株WYQ 23最適碳源為葡萄糖。在該基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了不同葡萄糖添加量對(duì)菌株WYQ23產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3B所示。由圖3B可知，當(dāng)葡萄糖添加量＞4%時(shí)，GOD酶活隨著濃度升高而降低，當(dāng)葡萄糖添加量＜4%時(shí)，GOD酶活也降低，因此，葡萄糖的最適添加量為4%。

圖3 不同碳源（A）及葡萄糖添加量（B）對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sources(A)and glucose addition(B)on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.2 有機(jī)氮源對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響

分別以0.3%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、玉米膏作為有機(jī)氮源，培養(yǎng)菌株WYQ 23，結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可知，當(dāng)有機(jī)氮源為蛋白胨時(shí)，GOD酶活最高為0.82U/mL，牛肉膏次之，為0.53 U/mL。當(dāng)有機(jī)氮源為酵母粉、玉米膏或尿素時(shí)，其酶活較低。不同蛋白胨添加量對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4B所示。由圖4B可知，在蛋白胨添加量＜0.4%時(shí)，GOD酶活隨著濃度增加而增大；在蛋白胨添加量＞0.4%時(shí)，GOD酶活隨著濃度增加而降低。因此，蛋白胨最優(yōu)添加量為0.4%。

圖4 不同有機(jī)氮源（A）及蛋白胨添加量（B）對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of different organic nitrogen sources(A)and peptone addition(B）on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.3 無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響

圖5 不同無(wú)機(jī)氮源（A）及NaNO3添加量（B）對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different inorganic nitrogen(A)and NaNO3addition(B)on enzyme production of strain WYQ 23

分別以0.4%的無(wú)機(jī)氮源NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3作為培養(yǎng)菌株WYQ 23，結(jié)果如圖5A所示。由圖5A可知，在無(wú)機(jī)氮源為NaNO3時(shí)GOD的酶活最高為0.94U/mL，KNO3次之，為0.77 U/mL。當(dāng)無(wú)機(jī)氮源NH4Cl、（NH4）2SO4或NH4NO3，其酶活較低。不同NaNO3添加量對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖5B所示。由如圖5B可知，在NaNO3濃度＜0.3%時(shí)，GOD酶活降低；在NaNO3濃度＞0.3%時(shí)，GOD酶活隨著濃度增加而降低。因此，NaNO3最優(yōu)添加量為0.3%。

2.3.4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響

分別對(duì)KH2PO4、MgSO4、KCl、CaCO3的添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，其最適添加量分別為MgSO40.07%、KCl 0.03%、KH2PO40.3%、CaCO30.6%。

圖6 KH2PO4（A）、KCl（B）、MgSO4（C）及CaCO3（D）添加量對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of KH2PO4(A),KCl(B),MgSO4(C)and CaCO3(D)addition on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響

不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在初始pH＜6.0時(shí)，隨著初始pH的升高GOD酶活逐漸增加；在初始pH＞6.0時(shí)，隨著初始pH的升高GOD酶活逐漸下降；發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)酶活力達(dá)到最高，為1.54 U/mL。因此，菌株WYQ 23的發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH值為6.0。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株WYQ 23生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on growth and enzyme production of strain WYQ 23

2.3.6 發(fā)酵溫度對(duì)WYQ 23產(chǎn)酶的影響

不同發(fā)酵溫度優(yōu)化結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，在發(fā)酵溫度低于25℃時(shí)，酶活隨著發(fā)酵溫度升高而升高；在發(fā)酵溫度高于25℃時(shí)，酶活隨著發(fā)酵溫度升高反而降低。因此，最優(yōu)發(fā)酵溫度為25℃。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain WYQ 23

2.3.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，因?yàn)槠咸烟恰⒌鞍纂恕aNO3及發(fā)酵溫度對(duì)酶活影響較大，因此選擇葡萄糖、蛋白胨、NaNO3添加量及發(fā)酵溫度進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，根據(jù)極差值可知各因素對(duì)菌株WYQ 23產(chǎn)酶的影響次序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞NaNO3添加量＞葡萄糖添加量＞蛋白胨添加量，最優(yōu)產(chǎn)酶條件組合為A2B1C2D2，即葡萄糖添加量4%，蛋白胨添加量0.3%，NaNO3添加量0.3%，發(fā)酵溫度25℃。在此優(yōu)化條件下，葡萄糖氧化酶酶活達(dá)到1.67 U/mL。

3 結(jié)論

本研究從大連黃海海域海泥樣品中篩選得到一株產(chǎn)低溫GOD的海洋酵母菌WYQ 23，對(duì)該菌株的ITS區(qū)進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定該菌株為擔(dān)子菌Basidioascussp.。該菌株產(chǎn)低溫GOD最優(yōu)產(chǎn)酶條件：葡萄糖4%、蛋白胨0.3%、NaNO30.3%、CaCO30.6%、MgSO40.07%、KCl 0.03%、KH2PO40.3%，初始pH 6.0，發(fā)酵溫度25℃。在此優(yōu)化條件下，該菌株產(chǎn)低溫GOD酶活力達(dá)到1.67 U/mL，是優(yōu)化前的2.53倍。