紫外-光復活誘變選育發酵玉米蛋白粉飼料的產朊假絲酵母

王 松，劉曉蘭*，江成英，鄭喜群

（1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學 農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國作為農業大國，畜牧業產品產量居世界前列，但是對于糧食和飼料在我國一直處于薄弱地位。同時，由于各種農作物及副產品的處理不當對資源與環境也造成了巨大壓力[1-3]。我國從20世紀90年代開始研究微生物發酵飼料，大量研究表明[4-6]，微生物發酵飼料可提高原料的營養價值、動物的消化利用率等特點，對建立一個正常，平衡的動物體內微生物生態系統起著重要的作用。當前，生物飼料的開發已逐漸成為我國飼料加工的熱點[7]。

玉米蛋白粉作為一種重要的蛋白飼料資源含有豐富的蛋白質，被廣泛應用于各類蛋白飼料生產中[8-10]，基于微生物發酵飼料的生產特點，利用微生物發酵玉米蛋白粉，不僅解決了玉米蛋白粉的浪費和吸收率問題，由于發酵產物中含有豐富的氨基酸等各類營養物質，還可有效提高動物的生長率[11]。

在發酵飼料行業中，產朊假絲酵母（Candida utilis）主要作為益生菌及飼用發酵菌劑使用，常被用于生產多種具有功能性的生物物質。研究表明[12]，飼料中添加產朊假絲酵母，提高了仔鵝生長性能，優化了其盲腸菌群。采用產朊假絲酵母混菌發酵玉米蛋白粉，可以提高其營養價值。并且近年來隨著誘變育種技術的發展，相對于單一的誘變方式，復合誘變能夠更好的提高目標微生物的各項功能性產物代謝量，如李學思等[13]從宋河大曲中酵法篩選出1株高產蛋白酶菌株MSPN-11，經紫外誘變技術得1株高產蛋白酶菌株MSPR 8，酶活提高了26.38%。朱明軍等[14]對產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌以紫外線、硫酸二乙酯為誘變劑，對其進行兩輪復合誘變，誘變菌的發酵液酶活較出發菌提高了59.68%。本研究采用紫外-光復活誘變方式對目標菌株進行處理，對目標菌株進行篩選[15]，進而得到高產蛋白酶的菌株，并將其應用于發酵玉米蛋白粉飼料生產，可有效提高飼料利用率，降低成本，具有良好的綠色與經濟前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產朊假絲酵母（Candida utilis）：齊齊哈爾大學生物工程實驗室保藏。

1.1.2 化學試劑

無水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、碳酸鈉、酪蛋白、酪氨酸、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸等（均為分析純或生化試劑）：天津市凱通化學試劑有限公司；脫脂牛奶：市售。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基[16]：2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，100 mL水，115℃，滅菌30 min。YPD固體培養基加入2%瓊脂；

脫脂牛奶培養基：A 5 g脫脂牛奶與50 mL蒸餾水混合；B 2 g瓊脂50 mL蒸餾水。A、B分別115℃滅菌20 min，冷卻至60℃混勻后倒入平板。

1.2 儀器與設備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱；上海躍進醫療器械廠；PHS-25數顯pH計；上海精密科學儀器有限公司；TV1901紫外可見分光光度計；北京譜析通用儀器有限公司；DSX-280不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；上海申安醫療器械廠；ZHJH-C2109C超凈工作臺；上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種生長曲線測定

采用比濁法測定出發菌株的生長曲線[17]。

1.3.2 菌懸液的制備

接種一環產朊假絲酵母至YPD液體培養基中，于28℃、200 r/min培養20 h，得到菌懸液。

1.3.3 紫外誘變

使用紫外燈對菌懸液進行不同時間（0～150s）的照射，每隔5s進行一次取樣，稀釋之后進行YPD平板涂布。將YPD平板倒扣培養進行菌落計數，繪制致死率曲線。致死率計算公式如下：

1.3.4 紫外-光復活誘變

對菌懸液采用最佳紫外誘變時間（120 s）進行照射，然后放置白熾燈下進行不同時間（0～30 s）的光復活照射，每隔5 s進行一次取樣，稀釋后進行YPD平板涂布，將YPD平板倒扣避光培養進行菌落計數，計算光復活率及正突變率，其計算公式如下：

1.3.4 突變株的篩選

將經紫外-光復活誘變處理后的菌懸液稀釋后涂布于脫脂牛奶平板上32℃，培養48 h。根據透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產蛋白酶活力較強的菌株。菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以表示菌株產蛋白酶能力的強弱，該比值越大，則代表菌株產蛋白酶能力越強。

1.3.5 酶活力測定

將篩選菌株接入YPD液體培養基，于32℃、180 r/min條件下搖床培養48 h，取培養液采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。

1.3.6 遺傳穩定性試驗

根據菌株產蛋白酶活力篩選出一株較出發菌株提高最大的突變株進行連續傳代試驗，將篩選所得菌株接入YPD固體培養基進行連續傳代5次培養后，取各代菌種接入液體培養基于32℃、180 r/min條件下搖床培養48 h，取培養液采用Folin-酚法測定其中性蛋白酶活力。

2 結果與分析

2.1 出發菌株的生長曲線

對微生物進行紫外誘變處理前，一般要求出發菌株應處于對數生長期，當菌株處于對數生長期時對紫外線照射更加敏感，易發生突變，而且處于對數生長期的菌種自身代謝能力強，相對穩定，生長速度快繁殖旺盛[18]。以產朊假絲酵母（Candida utilis）作為出發菌株，接種至YPD液體培養于32℃、180r/min條件下搖床培養，在波長600nm處測定不同生長時間的OD600nm值，繪制菌株生長曲線見圖1。

圖1 產朊假絲酵母生長曲線Fig.1 Growth curve ofCandida utilis

由圖1可知，0～4 h期間菌體濃度幾乎無變化，此時菌種處于生長延遲期。從第6小時開始菌體濃度劇增，此時菌種進入對數生長期，20h后菌種生長速度減緩，進入穩定期，30 h后，隨著菌種的生長緩慢，菌懸液濃度幾乎保持不變，進入衰亡期。結果表明，出發菌種的對數生長期為6～20 h，應選擇對數中前期的菌種進行紫外誘變處理。因此，選擇經過12 h培養的菌液進行紫外誘變處理。

2.2 紫外誘變處理

進行紫外誘變育種時，為了得出最佳誘變劑量，需先對出發菌種的紫外線致死率進行計算，產朊假絲酵母致死率曲線見圖2。

圖2 產朊假絲酵母致死率曲線Fig.2 Lethality rate curve ofCandida utilis

由圖2可知，隨著紫外線照射時間的增加，菌株的死亡率也隨之增加。產朊假絲酵母在紫外照射劑量為120 s時的致死率達到80%，由于致死率為80%時，紫外誘變處理的效果最佳，菌種正突變率最高。因此，采用120 s為產朊假絲酵母的最佳紫外誘變劑量。

2.3 紫外-光復活誘變[19]

在紫外照射120 s后放入白熾燈下進行不同時間（0～30 s）的光復活照射，通過平板涂布法計算光復活率，并測量計算透明圈直徑與菌落直徑比值，與單一誘變突變株進行比較，通過計數透明圈直徑比大于原始菌株直徑比的菌落數，與菌落總數的比值計算正突變率，產朊假絲酵母光復活率及正突變率曲線見圖3。

圖3 產朊假絲酵母光復活率及正突變率曲線Fig.3 Photoreactivation rate and positive mutation rate curve of Candida utilis

由圖3可知，隨著光復活時間在0～30 s范圍內增加，菌株光復活率也隨之由10.01%增加至32.42%。隨著光復活時間在0～30s內的增加，正突變率呈現先增加后減少的趨勢，并且在白熾燈照射劑量達到20 s時，菌株正突變率最大達到14.99%，隨后便隨著白熾燈照射時間的增加而減小。因此，確定在紫外照射120 s后，白熾燈照射20 s為最佳光復活劑量。

2.4 高產蛋白酶突變菌株篩選

2.4.1 紫外誘變突變株篩選

將出發菌株進行單一紫外誘變處理（紫外照射120 s）后，將其倒扣避光培養于32℃恒溫培養箱中48 h，根據透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產蛋白酶活力較強的菌株，并測定其酶活力，結果見表1。

表1 紫外誘變突變株的初篩Table 1 Primary screening of UV mutated strain

由表1可知，出發菌株透明圈與菌落直徑比值為7.62，由于脫脂牛奶培養基上菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以反映菌株產蛋白酶能力的強弱，該比值越大，則代表菌株產蛋白酶能力越強。所以通過120 s的紫外線照射，篩選出較出發菌株比值提高最大的5株突變株，其中以YC-3最大達到13.11，將篩選所得5株菌株于32℃搖床培養48 h后測定其酶活力，得出發菌株酶活力為21.93 U/mL，突變株中以YC-3酶活力最大達到35.55 U/mL，是出發菌株酶活力的1.62倍，但提升效果較差，為更好的提高菌株產蛋白酶能力，對經紫外誘變后的菌株再次進行光復活試驗。

2.4.2 紫外-光復活誘變突變株篩選

出發菌株的菌懸液經過紫外照射120 s后，再經白熾燈照射20 s，得到紫外-光復活誘變菌株，涂布于脫脂牛奶培養基于32℃恒溫培養箱培養48 h。計算透明圈直徑與菌落直徑比值，并測定其酶活力，結果見表2。

表2 紫外-光復活誘變的突變株篩選Table 2 Screening of mutant strain by UV photoreactivation mutagenesis

由表2可知，YC-3的透明圈與菌落直徑比值為13.11，從測得的突變株中篩選透明圈與菌落直徑比值＞13.11的突變株。經篩選共得出5株比值較YC-3提高最大的突變株，其中以突變株FC-20.14的比值最大為17.14。將篩選出的5株突變株分別接入YPD液體培養基中于32℃搖床培養48 h后離心取上清液測定其中性蛋白酶活力[20]，其中以突變株FC-20.14酶活力最高為64.18 U/mL。是單一紫外誘變的突變株YC-3的酶活力35.55 U/g的1.81倍，是出發菌株酶活力21.93 U/mL的2.93倍。

2.6 遺傳穩定性試驗

將突變株FC-20.14接至YPD斜面培養基上培養傳代。連續培養5代后，將每代均接種于YPD液體培養基中，測定其中性蛋白酶活力[21-24]，結果見表3。

表3 突變株FC-20.14遺傳穩定性Table 3 Genetic stability of mutant strain FC-20.14

由表3可知，對突變株FC-20.14進行連續傳代5次，酶活力稍有降低。從第1代至第5代，酶活力變化了0.21 U/mL，變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明連續傳代會對突變株FC-20.14的蛋白酶活力造成一定影響，但減少程度較小，由此可得出，該突變株遺傳性狀穩定，遺傳性能良好，可用作發酵玉米蛋白粉飼料。

3 結論

本研究通過紫外-光復活誘變育種篩選出一株遺傳性狀穩定的較出發菌株蛋白酶活力有明顯提高的產朊假絲酵母突變菌株FC-20.14用作微生物發酵玉米蛋白粉飼料，經測定出發菌株經單一紫外誘變過后，篩選出一株紫外突變株YC-3，蛋白酶活力為35.55 U/mL，較出發菌株的蛋白酶活力提高了0.62倍。經紫外-光復活誘變處理后，篩選出一株紫外-光復合突變株FC-20.14，該突變株透明圈直徑與菌落直徑比值為17.14，蛋白酶活力為64.18U/mL，較出發菌株提高1.93倍。通過遺傳穩定性試驗發現連續傳代5次后該突變株蛋白酶活力變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明其擁有穩定的遺傳性能，可用于發酵玉米蛋白粉飼料，為發酵玉米蛋白粉飼料的研究奠定了基礎。