柑橘酒發酵過程中總黃酮、檸檬苦素和諾米林含量變化

曾竟藍，馬胤鵬，秦 丹，2，曾 璐*，陳長松

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學 湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.天下果業開發有限公司，湖南 湘西自治州 416000）

柑橘酒具有酒精度低、酒質溫和爽口的特點，基本保留柑橘原有風味和功效，并且具有防衰抗老、潤肺、補肝、安神等保健作用[1]。柑橘酒中存在多種功能性成分，如類胡蘿卜素、黃酮類化合物和類檸檬苦素等。柑橘中的類黃酮是一種具有C6-C3-C6苯并呲喃酮結構的多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗病菌、抗炎、降低毛細血管脆性、抗過敏、抑制血小板凝集等多方面的藥理作用[2-3]。因此，柑橘酒中的黃酮含量可作為評價其營養保健價值的一個重要指標。類檸檬苦素是一類高度氧化的四環三萜類化合物，常以苷元和配糖體存在，具有抗氧化性、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮痛、抑菌抗病毒等多種生物活性[4-6]。據報道，現已分離出類檸檬苦素苷元36種，類檸檬苦素糖苷17種，其中檸檬苦素（limonin）和諾米林（nomilin）最具代表性[7]。果汁中的A-環內酯能在酸性條件下被檸檬苦素D-環內脂水解酶催化形成檸檬苦素，產生果汁加工“后苦”的現象[8]，尤其在冰凍、機械損害這類非正常條件下的水果組織破壞，可增加果肉酸度和提高酶活，促使檸檬苦素生成量增加[9]。在柑橘果汁加工中，通常認為檸檬苦素和諾米林為代表的苦味物質閾值為6 mg/L，超過該質量濃度則太苦而不宜用于飲料加工[10-11]。由此可知，檸檬苦素類似物雖具有多種生物活性，但它們帶來的苦澀味嚴重影響了柑橘酒的口感，制約著柑橘酒的發展[12-13]。因此，了解檸檬苦素類似物在柑橘酒釀造過程中的變化規律顯得尤為重要。

目前，有關柑橘酒的研究主要針對于產品品質和風味的提高，而其發酵過程中功能性成分的變化方面尚未見報道。基于此，本研究以實驗室自釀的柑橘酒為試驗材料，利用分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法分別對柑橘果酒發酵過程中發酵液的總黃酮和苦味物質（即檸檬苦素和諾米林）進行跟蹤監測，分析其含量在發酵過程中的變化趨勢，為以期為柑橘酒中功能性成分含量的提高，以及柑橘酒的進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：湖南湘西椪柑；酵母：意大利SC果酒酵母；蔗糖：廣西貴糖集團股份有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、硫酸、檸檬酸、二甘醇（均為分析純）、乙腈、磷酸（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬苦素標準品、諾米林標準品（均為色譜純）：成都曼斯特生物科技有限公司；橙皮苷標準品（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JYZ-E8型榨汁機：九陽股份有限公司；MJ-250B5-Ⅱ型生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；LXJ-IIB型離心機：上海安寧科學儀器廠；PHS-3B型酒精計：翼州市耀華器械儀表廠；JA2003N型電子天平：上海箐海儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PGSJ-3F型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；721型可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司；1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柑橘酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：將鮮果處理好后榨汁去渣，得椪柑濁汁，調整初始糖度為24%，接種SC果酒酵母，接種量為0.04%，發酵溫度控制在21℃，主發酵1～2周，殘糖量低至6 g/L后，轉入后發酵，溫度控制在15℃以下，后發酵持續約一個月，使殘糖降至2 g/L以下。后發酵結束后，用四層紗布過濾，分離酒腳，溫度控制在15℃進行陳釀3個月以上，在低溫條件下用棉餅（或硅藻土）過濾機過濾、裝瓶，得柑橘酒成品。

將整個發酵過程分為鮮果、起酵、發酵旺盛、主發酵、后發酵這五個階段來取樣分析酒中各指標的變化。

1.3.2 柑橘酒中總黃酮含量的測定

參照國標GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[14]，以橙皮苷標準品為對照，采用分光光度法測定柑橘酒中總黃酮的含量。

1.3.3 柑橘酒中檸檬苦素和諾米林含量的測定

采用HPLC法測定柑橘酒中檸檬苦素和諾米林的含量[15-16]。

樣品處理：準確吸取柑橘酒5 mL于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，搖勻，超聲處理20 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，平行制備3份待測液。

高效液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈∶0.1%磷酸水=55∶45（V/V）；柱溫35℃；流速1mL/min；進樣量10μL；檢測波長為210nm，波長掃描范圍為200～400 nm。

檸檬苦素和諾米林的標準曲線繪制：準確稱取檸檬苦素和諾米林標準品各90 mg，用乙腈超聲輔助溶解并定容至100 mL，搖勻，配成質量濃度均為90 mg/L的混合標準溶液。再依次稀釋成0.9 mg/L、1.8 mg/L、4.5 mg/L、9.0 mg/L、18 mg/L、45 mg/L的檸檬苦素和諾米林系列標準溶液，以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標分別繪制檸檬苦素和諾米林標準曲線。

1.3.4 其他理化指標的測定

酒精度：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法；總糖：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法；總酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示劑法[17]。

1.3.5 數據處理

應用Excel和SPSS20.0軟件進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 柑橘酒發酵過程中總糖含量和酒精度的變化

圖1 柑橘果酒發酵過程中總糖含量和酒精度的變化Fig.1 Changes of total sugar content and alcohol contents in citrus wine during fermentation process

由圖1可知，發酵前3 d，發酵液中總糖含量的變化不大，可能因為酵母菌剛接種處于菌體增殖起始期，酵母菌菌體數量在較低水平。觀察發酵液變化情況發現，第3天發酵液上層有少量氣泡產生而下層較平靜，進入起酵期。此時，發酵液中總糖含量緩慢降低，酒精度緩慢增加。第6天發酵液中有大量氣泡產生，進入發酵旺盛期。此時，發酵液中酵母菌的菌體數量呈對數增長，大量消耗糖分，發酵液中總糖含量急劇下降，酒精度含量快速上升。隨著發酵液中糖的消耗和酒精度的提高，酵母的生長繁殖受到抑制，在第16天時，無明顯起泡現象，視為主發酵結束。此時發酵液中總糖含量為5.75g/L，酒精度為14%vol。在后發酵階段，發酵液中總糖含量較低且下降緩慢，酵母生長繁殖活動減弱，酒精度無顯著變化。第45天柑橘酒的后發酵結束，此時發酵液中總糖含量為1.26 g/L，酒精度為14.7%vol。在整個發酵階段，酒精生成和糖降解速度呈現出一定的一致性。

2.2 柑橘酒中總黃酮含量的變化

不同柑橘種類含有的黃酮種類不同，本試驗中所用湘西椪柑屬于寬皮柑橘，其中黃酮類物質中黃烷酮含量較高，占黃酮總量的80%，且以橙皮苷為主[18]。因此，以橙皮苷為標準品測定柑橘酒中總黃酮的含量。

2.2.1 橙皮苷的標準曲線

以橙皮苷質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制橙皮苷標準曲線，結果見圖2。由圖2可知，橙皮苷標準曲線回歸方程為：y=0.009 1x+0.007 4，相關系數R2為0.999 6，表明二者線性關系良好。

圖2 橙皮苷標準曲線Fig.2 Standard curve of hesperidin

2.2.2 柑橘酒發酵過程中總黃酮含量的變化

圖3 總黃酮含量在柑橘酒發酵過程中的變化Fig.3 Changes of total flavonoids contents in citrus wine during fermentation process

由圖3可知，柑橘鮮果中總黃酮含量較高，未發酵的橘汁中總黃酮含量高達1747mg/kg。在果酒的起酵階段，總黃酮含量變化緩慢，隨著發酵的開始總黃酮含量的變化速率加快。在發酵旺盛時期，隨著酵母菌的快速繁殖，酒精的大量生成，果酒中總黃酮含量顯著下降（P＜0.05），而在果酒主發酵結束后，總黃酮含量下降較緩慢，并趨于平穩。在柑橘酒發酵過程中，總黃酮的含量呈下降趨勢?？傸S酮含量在主發酵時期下降較明顯，主發酵結束后，發酵液中總黃酮的含量下降到566.3 mg/kg，隨著主發酵的結束，發酵液中總黃酮含量的變化趨于穩定，后發酵結束時柑橘酒中總黃酮含量為544.32 mg/kg。在柑橘酒發酵過程中，柑橘酒總黃酮含量的降低一方面可能是由于酵母產生的次級代謝產物（如丙酮酸、乙醛等）與黃酮類物質反應，生成一些大分子衍生物，而導致酒中總黃酮含量下降；另一方面可能是在發酵過程中，微生物產生一些酶使其發生降解，導致其水溶性降低，從而使酒中總黃酮含量下降[19]。盡管柑橘酒中總黃酮含量有所下降，但其含量顯著高于其他果酒如枸杞酒[20-21]、山楂酒[22]等，因此，仍具有較大的商品價值。

2.3 柑橘酒中檸檬苦素和諾米林含量的變化

柑橘酒中最常見導致苦味的萜類化合物是檸檬苦素和諾米林，與其他萜類化合物相比，其含量在果實中較高，也與柑橘加工“后苦味”有關[23]。因此，選擇檸檬苦素和諾米林兩種物質為代表探究其在發酵過程中的變化。

2.3.1 檸檬苦素和諾米林的標準曲線

以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標分別繪制繪制檸檬苦素和諾米林的標準曲線見圖4。由圖4可知，檸檬苦素和諾米林標準曲線線性回歸方程分別為y檸=6.498 8x-0.095 2和y諾=6.498 8x-0.095 2，相關系數R2均為1，結果表明，檸檬苦素、諾米林在質量濃度0.9～45mg/L內具有良好的線性關系，可以用于定量檢測。

圖4 檸檬苦素和諾米林的標準曲線Fig.4 Standard curves of limonin and nomilin

2.3.2 柑橘酒發酵過程中檸檬苦素和諾米林的變化

由圖5可知，柑橘汁中檸檬苦素含量很低，為2.21mg/L。從起酵過程中檸檬苦素含量顯著升高至15.65mg/L（P＜0.05），但隨著發酵的進行，檸檬苦素的含量逐漸減少，直到主發酵結束，發酵液中檸檬苦素降至10.87 mg/L，在主發酵結束后，無顯著變化且趨于穩定（P＞0.05），諾米林的變化規律與檸檬苦素類似。在起酵的過程中其含量顯著增加至3.37 mg/L（P＜0.05），進入發酵旺盛期后小幅增加至3.55 mg/L。主發酵結束時，發酵液中諾米林含量顯著減少至2.20 mg/L（P＜0.05），在后發酵時期逐漸趨于平衡。新鮮的柑橘中檸檬苦素類似物的含量極少，經榨汁后柑橘中含有的A-環內酯暴露在酸性環境中，快速地被檸檬苦素D-環內脂水解酶催化水解，生成有苦味的檸堿[24-26]。因此，起酵時期發酵液中檸檬苦素、諾米林含量顯著升高（P＜0.05）。隨著發酵的進行和酵母的繁殖，在主發酵結束時，發酵液中檸檬苦素和諾米林含量顯著降低，可能是由于酵母發酵中產生的代謝產物與其反應，使其水溶性降低，發生沉降，導致發酵液中檸檬苦素、諾米林的含量降低。故而在發酵過程中，發酵液中檸檬苦素與諾米林的含量逐漸減少，直至趨于穩定。

圖5 檸檬苦素和諾米林在柑橘酒發酵過程中的變化Fig.5 Change of limonin and nomilin in citrus wine during fermentation process

3 結論

本試驗探究了總黃酮、檸檬苦素和諾米林含量在柑橘酒發酵過程中的變化。結果表明，在發酵過程中柑橘酒總黃酮呈持續下降的變化趨勢，主發酵結束后下降至566.3mg/kg，與原汁相比減少了67.58%。柑橘酒中檸檬苦素和諾米林均呈先增大后減小趨勢，起酵后含量達最高。經發酵后酒中檸檬苦素和諾米林顯著下降（P＜0.05），發酵結束時分別下降30.54%和34.72%。檸檬苦素、諾米林雖是柑橘酒中的重要功能性成分之一，但因其具有的“后苦味”，也是影響柑橘酒品質的重要苦味物質。因此，了解這些物質在柑橘酒發酵過程中的變化，有利于柑橘酒發酵工藝的改進，同時也為低苦、高黃酮含量柑橘酒的研發提供基礎數據。