黃酒對高脂血癥模型大鼠血脂及腸道菌群的影響

秦 文，王麗媛，楊 倬，王晶波，卓 勤，沈 葹，霍軍生，丁鋼強*

（中國疾病預防控制中心 營養與健康所，北京 100050）

黃酒以稻米、小米、黍米、玉米和小麥等為主要原料，經過蒸煮、加曲、糖化、發酵等工藝釀制而成，含有豐富的蛋白質、氨基酸、活性肽、酚類、低聚糖等營養成分，是營養價值較高的釀造酒[1-2]。作為我國傳統酒，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒，享有“國酒”之美譽[3]。但與啤酒和葡萄酒的研究相比，黃酒的研究大多集中于理化檢測和發酵工藝等方面，對黃酒的生理功效和活性物質研究還停留在起步階段[4]。

葉新苗等[5]研究了太旨黃特型紹興黃酒對高脂大鼠的降血脂功效，但其選用的是添加槐花、葛根等多種中藥材的特制黃酒，而非傳統的黃酒。倪贊等[6]通過鉛中毒模型小鼠發現，黃酒可降低鉛中毒小鼠血液和肝臟中的鉛含量；沈赤等[7]通過免疫缺陷小鼠發現，黃酒多糖可以提高免疫缺陷小鼠的免疫功能；馬良[8]通過觀察黃酒對慢性應激大鼠腸道微生物的影響，認為黃酒中富含的低聚糖可以促進腸道內乳酸菌的生長，對腸道微生物具有一定的調控作用；孟立平等[9]通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）敲除小鼠發現，黃酒多酚和黃酒多肽成分具有抑制高脂飲食誘導的LDLR小鼠動脈粥樣硬化的作用；王璟等[4]研究了黃酒對正常小鼠抗疲勞能力和D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠免疫器官的影響，發現黃酒能顯著提高小鼠體內肝糖原的含量，增加運動后小鼠血乳酸增長率，抑制衰老小鼠胸腺和脾臟質量的減少。近年來對腸道微生態的多項研究表明，腸道菌群能夠被環境和飲食影響，并對宿主健康產生重要作用，特別是與代謝相關的慢性疾病關系密切[10]。高脂血癥是引發老年人心腦血管疾病的一種常見慢性疾病，目前對傳統黃酒的降血脂功能及對腸道微生態的影響研究甚少。因此，本實驗通過高脂飼料喂養SD大鼠制作高脂模型，在灌胃不同劑量黃酒之后，通過測定高脂大鼠的體質量、肝臟質量、血脂以及腸道菌群，研究黃酒在高脂飼料模式下對實驗動物血脂及腸道菌群的調節作用，以期為黃酒的營養價值及腸道益生作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒（紹興黃酒，三年陳釀，酒精度為15%vol）：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司生產。

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠（雄性，體質量（200±20）g）：北京斯貝福（北京）生物技術有限公司[生產許可證：SCXK（京）2014-0006]。

高脂飼料（78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油和0.2%膽鹽）、動物基礎飼料：北京科奧協力飼料有限公司。

血脂四項測定試劑盒（總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒，993-33491、997-33391；甘油三酯（triacylglyceride，TG）（去游離甘油）測定試劑盒，999-32991、999-33091；高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒，991-09001、997-09101；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒，991-39891、997-39991）：和光純藥工業株式會社。腸道細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：深圳華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7600系列全自動生化分析儀：日本HITACHI公司；RV10V-C旋轉蒸發儀：德國IKA公司；BY-320C低速離心機：北京白洋醫療器械有限公司；Illumina HiSe2500測序儀：美國Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計：美國Thermo公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒的濃縮

黃酒經旋轉蒸發儀進行低溫真空濃縮，濃縮6倍。

1.3.2 動物實驗

動物飼養于中國疾病預防控制中心南緯路動物實驗室，許可證號SYXK（京）2009-0032，室溫（20～26℃），相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。適應3 d后根據體質量隨機分為2組，10只大鼠作為空白對照組給予基礎飼料，剩余40只作為模型組給予高脂飼料。模型組給予高脂飼料兩周后，空白對照組和模型組大鼠眼眶采血測定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C。根據TC水平將模型組隨機分為4組，即高脂模型組和3個劑量組，每組10只，分籠飼養。根據2016版《中國居民膳食指南》中建議的成年人每日飲用酒精量和黃酒的酒精含量，成人以60kg計，設定成人每日黃酒適宜攝入量為100mL。動物分組后，設黃酒低、中、高劑量組分別為8.3 mL/kg體質量、16.6 mL/kg體質量和50 mL/kg體質量（分別相當于人體推薦攝入量的5、10、30倍）[11]，由于大鼠最大灌胃量宜為10 mL/kg體質量，為達到黃酒不同劑量組濃度的要求，將黃酒進行濃縮后，再用酒基調制成不同濃度（最終酒精度均為15%vol）。空白對照組和高脂模型組給予等體積蒸餾水，灌胃量均為10 mL/kg體質量，連續灌胃30 d。實驗期間，空白對照組給予基礎飼料，高脂模型組和3個劑量組給予高脂飼料，每周稱質量一次，動物自由進食和飲水。實驗結束時，眼眶采血，離心收集血清待測；取肝臟稱重；取各組動物糞便-80℃冷凍保存待測。

本研究方案在通過中國疾病預防控制中心營養與健康所動物實驗倫理委員會審查許可后實施。

1.3.3 肝指數測定[12]

解剖大鼠取出大鼠肝臟，用脫脂棉擦拭后，稱質量。肝指數=肝質量/體質量。

1.3.4 血液生化指標

大鼠眼眶取血后于3000r/min離心15min，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C。

1.3.5 腸道菌群高通量測序分析

大鼠糞便樣品的DNA提取采用華大基因研發的腸道細菌DNA提取試劑盒，使用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rDNA的V4區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

應用IlluminaHiSe2500平臺對PCR產物進行測序，測序類型為PE250。下機數據濾除低質量的reads，獲得cleandata。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），將雙末端測序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）。得到OTU代表序列后，通過核糖體數據計劃（ribosomal database project，RDP）classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數據庫（Greengene V201305）已知序列比對進行物種注釋，置信度閾值設置為0.6。隨后進行物種復雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 動物模型的建立

模型組給予高脂飼料兩周后，空白對照組和模型組大鼠眼眶采血測定TC、TG、HDL-C和LDL-C，結果如表1所示。

由表1可知，模型組與空白對照組相比，上述四項指標差異均極顯著（P＜0.01），因此表明建模成功。

表1 建模后兩組大鼠血脂指標的檢測結果Table 1 Determination results of blood lipid indexes of two groups of rats after modeling

2.2 黃酒對大鼠體質量增量和肝臟指數的影響

表2 各組大鼠體質量增量和肝臟指數檢測結果Table 2 Determination results of body mass increment and liver index of different groups of rats

由表2可知，經灌胃30 d后，高脂模型組大鼠體質量增量和肝臟指數極顯著（P＜0.01）高于空白對照組，黃酒高、中、低劑量組大鼠體質量增量和肝臟指數與空白對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；與高脂模型組大鼠相比，黃酒中、低劑量組體質量增量顯著（P＜0.05）低于高脂模型組，高劑量組極顯著（P＜0.01）低于高脂模型組；黃酒高、中、低劑量組的肝臟指數均顯著（P＜0.05）低于高脂模型組。結果表明，黃酒能有效控制因高脂飼料引起的大鼠體質量增加，對高脂飼料引起的肝臟指數的升高具有一定的改善作用。

2.3 黃酒對大鼠血脂的影響

表3 各組大鼠血脂指標的檢測結果Table 3 Determination results of blood lipid indexes of different groups of rats

由表3可知，經灌胃30d后，高脂模型組大鼠的血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量與空白對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；黃酒高、中、低劑量組與空白對照組相比差異顯著或極顯著，與高脂模型組相比差異不顯著（P＞0.05）。雖然高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C值較高脂模型組有所下降，但差異不顯著（P＞0.05），表明實驗周期內黃酒對高脂大鼠的降血脂作用不明顯。

2.4 黃酒對高脂大鼠腸道菌群的影響

2.4.1 不同試驗組動物腸道菌群門水平的變化

各組樣品共產生834個OTU，被注釋到9個細菌門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres），各組菌群組成和比例如圖1所示。

圖1 各組大鼠腸道菌群在門水平上的注釋結果Fig.1 Annotation results of intestinal flora in different groups of rats based on phylum-level

厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中影響能量代謝平衡的兩個主要群落，多項研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門的含量和比例可作為判定肥胖潛在可能的依據[13-15]。XIE W等[16-17]研究發現，肥胖的動物或人比瘦的對照組具有更多的厚壁菌門和較少的擬桿菌門，與本研究結果一致，本實驗中，與空白對照組相比，高脂模型組中的厚壁菌門上升了39%，擬桿菌門下降了40%，黃酒中、低劑量組中的厚壁菌門分別上升了7%和6%，擬桿菌門分別下降了8%和10%，而高劑量組中的厚壁菌門下降了9%，擬桿菌門上升了9%，這一結果表明，黃酒能有效抑制高脂飼料引起的腸道菌群中厚壁菌門的上升和擬桿菌門的下降，使二者的含量和比值更接近于空白對照組，結合2.2中的結果分析，推斷黃酒有助于改善高脂飼料引起的厚壁菌門和擬桿菌門含量失衡，而二者含量失衡可能與高脂血癥大鼠體質量和肝臟指數的變化相關。

2.4.2 不同試驗組動物腸道菌群屬水平的變化

能夠進行物種注釋的OTU會隨著注釋等級的降低而減少，本實驗中能注釋到門的有97%以上，能注釋到屬的不到52%。在屬的水平上共比對到16個菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃菌屬（Prevotella）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、腸球菌屬（Enterococcus）、擬桿菌屬（Bac-teroides）、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、糞球菌屬（Coprococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、Turicibacter菌屬、大腸埃希氏菌屬（Escherichia）等。各組腸道菌群在屬水平上的注釋結果如圖2所示。

圖2 各組大鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結果Fig.2 Annotation results of intestinal flora in different groups of rats based on genus-level

由圖2可知，普雷沃菌屬在空白對照組，黃酒高、中、低劑量組中的豐度相對較高，其次是乳桿菌屬。與空白對照組相比，高脂模型組和黃酒低劑量組中的嗜粘蛋白-艾克曼菌屬組成比例分別下降了35%和28%，而黃酒高、中劑量組中的艾克曼菌屬組成比例分別上升了390%和481%；高脂模型組中的擬桿菌屬組成比例較空白對照組降低了63%，而黃酒高、中、低劑量組中的擬桿菌屬組成比例較空白對照組分別上升了70%、33%和14%，黃酒改善并提高了高脂大鼠腸道內艾克曼菌屬和擬桿菌屬的組成比例。結合2.2中的結果可知，艾克曼菌屬和擬桿菌屬組成比例與高脂大鼠體質量、肝臟指數的上升呈負相關。DAO M C等[18-20]研究表明，Akkermansia muciniphila（艾克曼菌屬中被注釋到的主要菌種）是腸道中的一種黏蛋白降解菌，在肥胖及相關代謝疾?。ㄈ缣悄虿。┲芯哂嘘P鍵作用，可以調節人體能量平衡及脂代謝水平，其組成比例與宿主的健康之間存在正相關。近年來，國內外學者對擬桿菌的益生作用進行了大量研究，發現它在幫助宿主分解多糖、加快腸粘膜血管形成以及提高宿主免疫力、維持腸道微生態平衡等方面起到了重要作用[21-22]。上述兩種菌有望成為新一代益生菌研究的方向。

2.4.3 不同試驗組動物腸道菌群多樣性的變化

Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[23]，其中包括Chao指數、Ace指數、Shannon指數以及Simpson指數。其中Chao指數和Ace指數反映樣品中群落的豐富度，即簡單指群落中物種的數量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況，Shannon和Simpson指數反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性[24]。由表4可知，空白對照組的Chao指數、Ace指數及Shannon指數要相對高于其他組，Simpson指數要相對低于其他組，但五組之間的各項指標差異均無顯著性（P＞0.05）。因此可推斷，高脂飼料或黃酒對大鼠腸道菌群的α-多樣性沒有顯著影響。

表4 腸道菌群α-多樣性指數比較Table 4 Comparison of alpha diversity index of intestinal flora

3 結論

黃酒能有效控制因高脂飼料引起的大鼠體質量增加以及肝臟指數的升高，在實驗周期內對因高脂飼料引起的大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量的上升和HDL-C含量的下降無明顯的改善作用。因高脂飼料和黃酒引起的大鼠腸道菌群改變中，在門水平上，黃酒能有效抑制高脂飼料引起的大鼠腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門比值的升高，使二者的含量和比值更接近于空白對照組，改善高脂飼料引起的厚壁菌門和擬桿菌門含量失衡。在屬水平上，黃酒改善并提高了高脂大鼠腸道內艾克曼菌屬和擬桿菌屬的組成比例。