基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜的白酒基酒等級判別

孫宗保，周 軒，吳建峰*，鄒小波，孫 瑩，唐群勇，霍玲玲

（1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 淮安 223411；3.江蘇大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

白酒在我國歷史悠久，在人們的生活中有著無可替代的地位，不同等級白酒的口感、風(fēng)味及價格都相差甚異。白酒基酒的品質(zhì)和等級決定了成品酒的質(zhì)量和等級，不同等級的基酒可以勾兌出不同風(fēng)格、不同口感和不同等級的成品酒。同時準(zhǔn)確判別白酒基酒等級也是白酒分級儲藏的主要依據(jù)。因此，白酒基酒等級的準(zhǔn)確評判至關(guān)重要。如今部分企業(yè)對白酒基酒質(zhì)量等級的鑒定仍主要依靠人工感官評定，但是人工感官評定存在著一定的個體差異性、不穩(wěn)定性和局限性，由主觀因素導(dǎo)致的評價標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，使得不同等級產(chǎn)品間的差異難以量化。因此，發(fā)展一種快速有效的白酒基酒等級和品質(zhì)評價技術(shù)顯得尤為必要。

目前，白酒質(zhì)量等級的研究主要采用近紅外光譜[1]、熒光光譜[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[3]、傳感技術(shù)等。光譜法檢測成本低，易操作，但靈敏度欠佳；電子鼻用傳感器陣列取代了人工嗅覺，但單一性強(qiáng)，且對環(huán)境溫度敏感[4]；氣相色譜-質(zhì)譜選擇性好，應(yīng)用廣泛，但白酒微量成分眾多，普通的質(zhì)量分析器無法檢測到痕量物質(zhì)。近年來，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，逐步應(yīng)用到白酒研究中，如程平言等[5-6]采用頂空固相微萃取與質(zhì)譜（headspace-solid phase microextractionmass spectrometry，HS-SPME-MS）聯(lián)用技術(shù)結(jié)合支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、逐步判別分析（stepwise linear discriminant analysis，SLDA）對濃香型和清香型白酒等級進(jìn)行鑒定。尤其是具有高分辨率、高靈敏度的四級桿-靜電場軌道阱Q-Exactive臺式質(zhì)譜儀，與超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）結(jié)合，能快速采集數(shù)據(jù)并精確測定質(zhì)量數(shù)，被廣泛應(yīng)用于食品成分和品質(zhì)的檢測研究[7-9]，如真實(shí)性評估、農(nóng)藥殘留、生物毒素[10-12]等。在酒精類飲品中也逐步得到推廣和使用[13-15]，特別是在白酒品質(zhì)檢測方面，取得了很好的效果，如穆蕾等[16]采用高分辨質(zhì)譜法鑒定出馥郁香型白酒中73種微量成分；ZHAO X R等[17]采用超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜建立了白酒等發(fā)酵液中氨基甲酸乙酯的檢測方法；CHEN D W等[18]采用高分辨質(zhì)譜建立了一種簡便、快速檢測白酒中了17種鄰苯二甲酸酯的方法。此外在白酒香型鑒定上也得到很好地應(yīng)用，如程明川等[19]采用Orbitrap高分辨質(zhì)譜與代謝組學(xué)分析，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）降維處理對3種香型白酒成功進(jìn)行鑒別。可以看出高分辨質(zhì)譜對白酒成分及品質(zhì)安全檢測具有高效快捷的效果，但是對白酒等級的研究鮮有報道。白酒中揮發(fā)性成分眾多，細(xì)微的變化也能使白酒口感風(fēng)味產(chǎn)生差異，因此本研究從白酒揮發(fā)性成分出發(fā)，采用超高效液相色譜（UPLC）與基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HR-MS）技術(shù)聯(lián)用，經(jīng)組學(xué)分析軟件SIEVE篩選處理，使用多種化學(xué)計量學(xué)方法對不同等級濃香型白酒基酒進(jìn)行鑒別，并比較不同模型的識別效果，以期建立一種客觀、準(zhǔn)確的白酒基酒等級鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒基酒：由江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司提供，公司專業(yè)感官評定人員根據(jù)感官評定標(biāo)準(zhǔn)和流程將車間工人初步分級的白酒基酒進(jìn)行感官品評分級，試驗(yàn)最終選取由專業(yè)感官評定人員確定的一級好、一級差、二級好、二級差基酒各30個樣本（共120個）。甲醇、甲酸（均為色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨（色譜純）：美國Sigma公司；娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000超高效液相色譜：美國Dionex公司；四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司；KQ-300DE超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；AR224CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

樣品經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C8（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相組成：水相（W）為5 mmol/L甲酸銨以及0.1%甲酸水溶液，有機(jī)相（M）為5 mmol/L甲酸銨以及0.1%甲酸甲醇溶液；進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3 質(zhì)譜掃描參數(shù)

表2 白酒基酒分析質(zhì)譜掃描參數(shù)Table 2 Scan parameters of base liquor ofBaijiuby mass spectrum

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

選擇正負(fù)離子切換采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用SIEVE組學(xué)分析軟件對白酒組分進(jìn)行提取、過濾（P＜0.05）后，運(yùn)用Matlab 2009a（Math works Co，USA）軟件進(jìn)行處理，分別采用主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）、支持向量機(jī)（SVM）以及反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation-artificial neural network，BP-ANN）等化學(xué)計量學(xué)方法對不同等級白酒基酒進(jìn)行建模分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)重現(xiàn)性

為了保證數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)樣過程中穿插了質(zhì)量控制（quality contral，QC）樣品，考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。在整個進(jìn)樣周期內(nèi)，以一級好酒樣本中某一化合物為例，其保留時間（retention time，RT）偏差應(yīng)在2 s以內(nèi)，響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在10%左右，質(zhì)量測量精度偏差＜10-6。采用外標(biāo)法進(jìn)行校正后，結(jié)果證明系統(tǒng)有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和較高的質(zhì)量精度，一級好酒樣本色譜圖見圖1。

圖1 不同定性方法對一級好酒樣本GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 TIC of first grade wine sample with different qualitative methods by GC-MS

2.2 不同等級白酒的識別結(jié)果

從四種不同等級白酒基酒120個樣本中，隨機(jī)選取總樣本的2/3（80個）作為訓(xùn)練集，余下的1/3樣本（40個）作為預(yù)測集。經(jīng)SIEVE軟件篩選分析后得到309個化合物，以不同樣本中309個化合物的峰面積組成數(shù)據(jù)矩陣，采用主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）、支持向量機(jī)（SVM）以及反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）等化學(xué)計量學(xué)方法對4種不同等級的白酒進(jìn)行區(qū)分。

2.2.1 主成分分析（PCA）

全部化合物的三維主成分空間分布圖見圖2。由圖2可知，其中第一主成分（the first principal component，PC1）、第二主成分（PC2）和第三主成分（PC3）的方差貢獻(xiàn)率分別為86.59%、3.05%、2.58%，累積方差貢獻(xiàn)率為92.22%，在保留大部分信息的同時，也反應(yīng)了化合物在原始變量空間中的分布，并在多維空間將不同等級白酒的差異可視化。從圖2可以看出，四種等級的白酒在該得分圖中分類趨勢較為明顯，說明這四種等級的白酒有一定的差異性。但是從PCA分析結(jié)果來看，不同等級樣本間仍然存在一定的交叉重疊，需要進(jìn)一步運(yùn)用模式識別方法將其區(qū)分開。

圖2 白酒樣本三維主成分得分圖Fig.2 Score plot of 3-dimension principal components of Baijiusamples

2.2.2 LDA、SVM和BP-ANN分析

不同等級白酒全部化合物的LDA二維得分圖見圖3。由圖3可知，其第一判別因子和第二判別因子的貢獻(xiàn)率分別為85.48%和8.64%，累計貢獻(xiàn)率為94.32%。四個等級白酒各居一個象限，除個別樣本外，聚類現(xiàn)象明顯，能很好地區(qū)分開。隨著主成分個數(shù)的改變，LDA的識別率也不同，識別率的變化情況見表3。可以看出，隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，LDA模型訓(xùn)練和預(yù)測的識別率都逐漸增加，當(dāng)主成分達(dá)到13時，模型準(zhǔn)確率最高，訓(xùn)練集識別率為91.25%，錯誤識別7個樣本，測試集識別率為90.00%，4個樣本被預(yù)測錯誤，結(jié)果表明，所建立的LDA模型對白酒基酒等級判別有較好的識別效果。

圖3 白酒樣本線性判別分析二維得分圖Fig.3 Score plot of 2-dimension ofBaijiusamples analysis by LDA

表3 LDA、SVM、BP-ANN在不同主成分下訓(xùn)練和測試的結(jié)果Table 3 Discriminating results of training set and test set of LDA,SVM and BP-ANN under different principal components

支持向量機(jī)（SVM）以結(jié)構(gòu)風(fēng)險最小化為原則建立模型，能兼顧經(jīng)驗(yàn)風(fēng)險與置信區(qū)間這兩個實(shí)際風(fēng)險因素，最終訓(xùn)練得到有良好泛化性的模型[20]。試驗(yàn)中，將訓(xùn)練和預(yù)測時的誤判數(shù)作為考察模型優(yōu)劣的一個指標(biāo)，從表3可以看出，和LDA模型的識別結(jié)果相似，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為1和2時，訓(xùn)練集和測試集識別率均不高，樣本誤判數(shù)20左右；隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，訓(xùn)練集和測試集的識別率都逐漸上升，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)達(dá)到15時，識別率最高分別為100%和97.50%，此時主成分的累積貢獻(xiàn)率為98.64%，訓(xùn)練時模型完全正確，預(yù)測時模型誤判數(shù)1個。

在建立反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（BP-ANN）過程中，以響應(yīng)信號的識別率作為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臈l件[21]，通過比較多次試驗(yàn)結(jié)果，對BP-ANN模型的各個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)反復(fù)訓(xùn)練后各參數(shù)最終確定為：目標(biāo)誤差0.001，學(xué)習(xí)速率0.1，動量因子0.7，網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)次數(shù)1 000次[22]。訓(xùn)練結(jié)果從表3可以看出，主成分?jǐn)?shù)為1時，由于其方差貢獻(xiàn)率較小，所解釋的樣本信息較少，因此訓(xùn)練集和測試集識別率不高，所建模型效果較差。隨著主成分?jǐn)?shù)不斷增加，訓(xùn)練集識別正確率不斷提高，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為8時，訓(xùn)練集與測試集的識別正確率均達(dá)到100%，無錯誤識別樣本；隨著主成分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，訓(xùn)練集模型的識別正確率又略有下降，但依然在97.00%以上，最多錯誤識別2個樣本。

2.2.3 不同識別模式分析結(jié)果的比較

將不同等級白酒基酒在主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）、支持向量機(jī)（SVM）和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）等多種模式下的最佳識別結(jié)果進(jìn)行比較，其中PCA區(qū)分效果較好，前3個主成分解釋了白酒化合物92.22%的信息。LDA、SVM和BP-ANN分別在主成分?jǐn)?shù)為13、15和8時得到最佳識別效果。三種識別模型中，BP-ANN的識別效果最好，訓(xùn)練集和測試集識別率均為100%，預(yù)測性能最佳；其次是支持向量機(jī)，訓(xùn)練集和測試集識別率分別高達(dá)100%和97.50%；LDA訓(xùn)練集和測試集識別效果要略差于這兩種非線性分析方法，但訓(xùn)練集和測試集識別正確率也分別達(dá)到91.25%和90%。原因可能是不同等級白酒中的揮發(fā)性成分之間存在著復(fù)雜的非線性關(guān)系，這恰好是適合BP-ANN處理的模型問題，因而BP-ANN要優(yōu)于LDA分析結(jié)果，此外，BP-ANN能夠解決SVM建模過程中過擬合的缺點(diǎn)[23]。總的來說，四種方法對不同等級白酒基酒中揮發(fā)性物質(zhì)的細(xì)微差異均得到較好的識別效果，訓(xùn)練集和測試集的最佳判別率均在90.00%以上，因此，化學(xué)計量學(xué)與UPLC-QExactive-MS技術(shù)相結(jié)合能快速有效鑒別不同等級濃香型白酒基酒。

3 結(jié)論

采用UPLC-Q-Exactive-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法判別不同等級白酒基酒。經(jīng)組學(xué)分析得到309種化合物后，分別利用PCA、LDA、SVM和BP-ANN四種方法從揮發(fā)性成分的角度對白酒基酒等級進(jìn)行判別、分析。結(jié)果表明，PCA區(qū)分效果較好，前3個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)92.22%，另外三種模式識別方法均達(dá)到較好的識別效果，訓(xùn)練集和測試集的最佳識別率均在90%以上，其中BP-ANN在主成分?jǐn)?shù)為8時，識別效果最優(yōu)，其訓(xùn)練集和測試集識別正確率均達(dá)到100%。實(shí)驗(yàn)證明，UPLC-Q-Exactive-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析方法能根據(jù)白酒基酒中揮發(fā)性成分的差異實(shí)現(xiàn)等級的有效判別，為濃香型白酒基酒質(zhì)量等級的劃分提供一定指導(dǎo)作用。