PCR-DGGE法分析酸菜中乳酸菌的多樣性

燕平梅，魏愛麗，李潤花，李 娜，趙文婧，陳燕飛

（1.太原師范學院 生物系，山西 太原 030619；2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，山西 太原 030619）

酸菜是日常生活中常見的發(fā)酵類食品，含有大量的可食用營養(yǎng)成分，浸制的過程能產(chǎn)生天然的植物酵素，具有保持胃腸道正常生理功能的作用[1]，酸菜發(fā)酵中乳酸菌起重要的作用[2-6]。酸菜發(fā)酵過程中會產(chǎn)生硝酸鹽和亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是一種化學致癌物，醫(yī)學研究證明，人體攝入的硝酸鹽在細菌的作用下，可以還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可使血液的運氧能力下降，還會形成強致癌物亞硝胺。亞硝酸鹽的形成與發(fā)酵蔬菜中微生物密切相關(guān)[7]，因此，微生物多樣性是研究酸菜的焦點。

變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）是將同一種屬的不同長度的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段分開[8]，其原理是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開[9-11]。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到的條帶的熒光強度反映了該菌的豐富度，條帶越亮，表示該種菌的數(shù)量越多[12]。該技術(shù)被廣泛應用于各種環(huán)境微生態(tài)的研究，如高溫熱泉等[13]。DGGE在國外還被廣泛用于食品微生態(tài)的研究，鑒定微生物種類，評估食品質(zhì)量，如益生制品、酸面團、干酪等[14]。

有研究報道，酸菜中含有豐富的細菌和真菌，其中，細菌主要有干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、醋酸桿菌（Acetobacter aceti）等，真菌主要為德巴利漢遜酵母（Debaryomyces hansenii），酸菜發(fā)酵過程中真菌種類比細菌種類少[4]。劉曉輝等[15-16]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從酸菜中分離乳酸菌，并鑒定為短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）、植物乳桿菌（Lactobacillusplanetarium）和腸膜明串珠菌（Leuconostocmesen teroides）；叢敏等[17]采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合DGGE技術(shù)對發(fā)酵第40天的酸菜分析得出，酸菜的主要優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬，包括植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳桿菌、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）等。

本研究以市售散裝酸菜SA和袋裝酸菜SB、SC為研究對象，采用PCR-DGGE的方法分析酸菜中乳酸菌的多樣性，為探究酸菜發(fā)酵機理奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

散稱酸菜（SA）、廣樂牌泡酸菜（SB）、松源牌酸菜（SC）：均購買于太原美特好超市長風店。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒：索萊寶生物有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺、去離子甲酰、過硫酸銨、尿素（均為分析純）：美國AMRESCO公司；2×TaqMaster Mix、DH5a感受態(tài)細胞：天根生物技術(shù)有限公司；引物：由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器與設備

TC-96（G）H（b）B Life Touch基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；DcodeTM凝膠成像系統(tǒng)、DcodeTM濃度梯度電泳儀：美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酸菜中食鹽及亞硝酸鹽含量的測定

食鹽含量：采用硝酸銀滴定法進行測定[18]；亞硝酸鹽含量：按照國標GB/T 5009.33—2008《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定方法》進行測定[19]。

1.3.2 酸菜湯汁中細菌總DNA的提取

分別取3種酸菜湯汁32 mL，10 000 r/min離心10 min。棄去廢液，收集沉淀，用濾紙小心吸干，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取3種酸菜中細菌的總DNA。

1.3.3 PCR擴增

分別以3種酸菜中細菌的總DNA為模板，WBAC1（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG-3′）和 WBAC2（5′-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3′）為引物對細菌的16S rDNA V7-V8基因序列進行PCR擴增。

PCR擴增體系：引物WBAC1和WBAC2各1 μL、模板DNA 1.5 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL，加雙蒸水（ddH2O）補充至25 μL。

PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸8 min，最后于4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.4 變性劑梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 Formula of denaturing gradient gel

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DGGE后，切割回收電泳條帶，將其作為模板進行PCR擴增，16S rDNA V7-V8的PCR擴增產(chǎn)物與pGM-T Vector連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a。挑取陽性克隆子送至上海生物工程公司測定基因序列。

1.3.5 DGGE圖譜分析

DGGE條帶結(jié)構(gòu)多樣性分析：采用Quantity One軟件自動分析確定DGGE圖譜上每個條帶的位置和相對光密度值。DGGE泳道內(nèi)的電泳條帶數(shù)量用以計算物種豐富度（R），運用電泳條帶相對密度值計算物種均勻度（E）及物種多樣性（H）[19]。多樣性指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）及豐富度指數(shù)（R）的計算公式：

式中：ni為單一條帶的峰面積；N為某一泳道所有峰面積；S為某一泳道的總條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 食鹽含量的測定

3種酸菜食鹽及亞硝酸鹽含量測定結(jié)果見表2。

表2 3種酸菜食鹽及亞硝酸鹽含量Table 2 Salt and nitrite contents in three kinds of sauerkraut

由表2可知，在3種不同廠家的酸菜中，散裝酸菜的食鹽含量（0.73 mol/L）顯著高于兩種袋裝酸菜（0.17 mol/L、0.30 mol/L）（P＜0.05）；兩種袋裝酸菜中食鹽含量無顯著差異（P＞0.05）。散裝酸菜的亞硝酸鹽含量（8.40 mg/kg）顯著高于兩種袋裝酸菜（1.20 mg/kg、1.20 mg/kg）（P＜0.05），是袋裝酸菜的7倍。兩種袋裝酸菜食鹽含量無顯著差異（P＞0.05）。我國國標規(guī)定的醬腌菜中的亞硝酸鹽含量應≤20 mg/kg[20]，說明3種酸菜的亞硝酸鹽含量均符合國家標準，均可放心食用。

2.2 PCR-DGGE結(jié)果

2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳分析

對16S rDNA V7-V8片段的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

由圖1可知，3種酸菜的16S rDNA V7-V8 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰，純度高，說明提取的DNA可以用于DGGE分析。

2.2.2 變性劑梯度凝膠電泳分析

由于PCR擴增產(chǎn)物分別是3種酸菜中所有微生物16SrDNA V7-V8片段基因的混合，為了鑒定酸菜中原核微生物多樣性，因此，需要使用DGGE技術(shù)進行分離，DGGE結(jié)果見圖2。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物DGGE結(jié)果Fig.2 DGGE results of PCR amplification products

由圖2可知，每個酸菜樣品中都有不同的條帶，酸菜SA有3條電泳帶（SA1、SA2、SA3）；酸菜SB有兩條電泳帶（SB1、SB2）；酸菜SC有3條電泳帶（SC1、SC2、SC3）。

采用Quantity One軟件對8條電泳帶進行分析，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到3種酸菜樣品DGGE條帶的多樣性指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）、豐富度指數(shù)（R），結(jié)果見表3。

表3 3種酸菜樣品DGGE條帶的指數(shù)分析結(jié)果Table 3 Indexes analysis results of DGGE band of three kinds of sauerkraut samples

由表3可知，3種酸菜樣品DGGE條帶的均勻度指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。散裝酸菜樣品DGGE條帶的多樣性指數(shù)顯著大于兩種袋裝酸菜（P＜0.05），兩種袋裝酸菜樣品DGGE條帶的多樣性指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。散裝酸菜樣品DGGE條帶的豐富度指數(shù)顯著大于袋裝酸菜SB（P＜0.05），與袋裝酸菜SC無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，酸菜的包裝影響乳酸菌的多樣性和豐富性。

2.2.3 測序結(jié)果分析

3種酸菜的DGGE條帶數(shù)量和遷移率均不同，為了研究酸菜中乳酸菌的種類，回收DGGE結(jié)果的每個電泳條帶，經(jīng)克隆、測序后，測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank庫序列進行比對分析，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵酸菜細菌群落的DGGE圖譜條帶測序結(jié)果Table 4 Sequencing results of DGGE band of bacterial community in fermented sauerkraut

由表4可知，散裝酸菜SA的3條回收帶即SA1、SA2、SA3分別與乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、非培養(yǎng)細菌（uncultured bacterium）、非培養(yǎng)乳球菌屬（unculturedLactococcussp.）的相似度較高，為97%、96%、98%；袋裝酸菜SB的兩條回收帶即SB1、SB2分別與Lactobacillus homohiochii、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）的相似度較高，為98%、98%；袋裝酸菜SC的3條回收帶即SC1、SC2、SC3分別與寡發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus oligofermentans）、Lactobacillus homohiochii、非培養(yǎng)乳桿菌屬（unculturedLactobacillussp.）的相似度較高，為96%、95%、97%。結(jié)果表明，散裝酸菜中非培養(yǎng)微生物含量比袋裝酸菜中多，兩種袋裝酸菜均含有乳桿菌屬（Lactobacillussp.）和Lactobacillushomohiochii，散裝酸菜與袋裝酸菜乳酸菌系不同。

3 結(jié)論

采用PCR-DGGE技術(shù)對3種酸菜中乳酸菌的多樣性進行研究。結(jié)果表明，散裝酸菜中乳酸菌的多樣性指數(shù)顯著高于袋裝酸菜（P＜0.05）。散裝酸菜與袋裝酸菜乳酸菌系不同，散裝酸菜SA中含有Lactobacillussp.、uncultured bacterium、unculturedLactococcussp.；袋裝酸菜SB中含有Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus curvatus；袋裝酸菜SC中含有Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus homohiochii、unculturedLactobacillussp.，兩種袋裝酸菜中均存在乳酸桿菌屬（Lactobacillussp.）和L.homohiochii。