微生物β-甘露聚糖酶的研究進展

張建新，宋宜樂，馮軍廠，常緒路*

（河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007）

β-甘露聚糖酶在動物生產、飼料、食品、醫藥、石油開采及生物技術等方面廣泛應用[1]，有關β-甘露聚糖酶的最初報道可以追溯至20世紀初到20世紀50年代[2]，1960年研究學者DOETSEH等論述了能產β-甘露聚糖酶的細菌，之后到1965年，SHIBATA闡述了β-甘露聚糖酶的界定，為日后有關內容的研討提供了理論依據[3-5]。70年代后，學者又進行了大量產β-甘露聚糖酶菌種的挑選、培育誘導，考察培養基對菌種產酶的影響。根據多年來大致的統計已有100余種能產此酶的微生物，探究最多的有細菌屬的芽孢桿菌、枯草桿菌；真菌屬的木霉菌、放線菌等。后來，人們進一步對不同來源的β-甘露聚糖酶進行純化處理，對該酶的基礎特性有了新的認識。

β-甘露聚糖酶不但是內切水解酶還是胞外誘導酶，其能被水解底物誘導，從而催化甘露多糖、異甘露多糖降解[1-4]；還可將這些糖類中的β-1,4-甘露糖苷鍵降解，分解成甘露寡糖。除此之外，在含有纖維素成分原料的分解過程中β-甘露聚糖酶也有應用，已經在生物制膠、食物增甜劑、織物、水產動物日糧、醫學藥物、工具酶、石油開采等行業中有著相當廣泛的應用[5]。

1 甘露聚糖

甘露聚糖是半纖維素（hemicellulose）中含量僅次于木聚糖的第二大復合物[6]，它以β-1,4-糖苷鍵鏈接構成主鏈的基本骨架，由半乳糖、葡萄糖等以α/β-1,6-糖苷鍵鏈接成支鏈[7-9]。根據其構造分為線性甘露聚糖（linear mannan）、葡甘露聚糖（glucomannan）、半乳甘露聚糖（galactomannan）和半乳葡萄甘露聚糖（galactoglucomannan）[10]。它們在蔬菜、水果、豆制品、乳制品以及海鮮等食品的保鮮和防腐方面有很廣泛用途。

甘露聚糖的水解產物是甘露寡糖，具有良好的生理調節功能，能有效降低人體膽固醇水平，減少便秘，降低血糖等，還可以利用腸內微生物調節腸道菌群環境。具有增強有益菌抑制有害菌的生長和代謝的作用，如促進雙歧桿菌的生長，因此是一種很好的食品添加劑。

2 β-甘露聚糖酶的來源

甘露聚糖在自然條件下水解成甘露寡糖主要是β-甘露聚糖酶的作用。β-甘露聚糖酶在大自然中的來源非常豐富，根據不同來源可分為植物來源（如刺槐、豆類及椰果等）、動物來源（如海洋軟體動物、蝸牛等低等動物）以及微生物來源等，其中微生物來源方面產β-甘露聚糖酶的報道最為常見[11-12]。在植物中，β-甘露聚糖酶常見于軟木（如稻草）和發芽的植物種子（如咖啡、胡蘿卜、西紅柿等），果實（如番茄、椰子等）和貯藏器官（如萵苣等）。動物來源的β-甘露聚糖酶種類比植物少，并且主要由海洋軟體動物（例如貽貝，皺紋盤鮑等）產生。β-甘露聚糖酶的最大來源是微生物，如細菌中的假單胞菌（Pseudomonas），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；真菌中的青霉屬（Penicilliumsp.）和曲霉屬（Aspergillussp.）。

此外，微生物來源的β-甘露聚糖酶不僅因為微生物資源的廣泛，低成本，便利的培養條件和簡單的操作提取，并且其活性高，通過在極端環境中篩選可以得到溫度耐受性好的較大選擇范圍的酶源，較動植物來源的β-甘露聚糖酶具有更廣的適用范圍，目前在生產生活上得到了很大的推廣與應用。

3 β-甘露聚糖酶的分子結構

1991年，Henrissat根據氨基酸序列同源性和疏水性氨基酸簇的分類將β-甘露聚糖酶分為糖苷水解酶家族5（GH5）和糖苷水解酶家族26（GH26）[13]。2008年ZHANGYL等[14]將其所研究酸熱脂環酸桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）Tc-12-31來源的胞內β-甘露聚糖酶劃分為糖苷水解酶家族113（Glycosylhydrolasefamily113，GH113），這是β-甘露聚糖酶第一次被歸入一個新的家族，編碼320個氨基酸。2015年，一個新的糖苷水解酶家族134被鑒定，它起源于鏈霉菌、黑曲霉和米曲霉[15-17]。與過去五年報道的β-甘露聚糖相比，目前僅發現18～19 kDa的最小蛋白分子質量甘露聚糖酶，一般酶的蛋白分子質量為33～55kDa。2012年，ASPEBORGH等[18]將GH5家系劃分為51個亞家族。GH5家族的甘露聚糖酶可分為GH5_7、GH5_8、GH5_10、GH5_17和GH5_36亞家族。這五個亞家族中β-甘露聚糖酶的來源既有真核生物又有細菌，其成員序列有很大差別，相似性較低（＜20%）[19]，屬于GH26的β-甘露聚糖酶主要來源于細菌。GH5中的β-甘露聚糖大部分包含兩個模塊，獨立的催化區和非催化區。其中，非催化結構域主要是碳水化合物結合結構域（carbohydrate binding element，CBM），與纖維素具有較好的特異性結合。研究表明，β-甘露聚糖酶的模塊結構與甘露聚糖骨架的識別及其側鏈的調節機制有關，但它們通常存在于酶的不同位置，具有CBM的β-甘露聚糖酶可顯著提高甘露聚糖與纖維素復合物等不溶性物質的水解速率[20]。然而，也有一些酶，如GH26中的β-甘露聚糖酶，它們只具有催化結構域。

目前，已經鑒定出十多種β-甘露聚糖酶的三維結構，如低等動物中的貽貝、植物中的西紅柿[21]和真菌中的里氏木霉（Trichodermareesei）。根據獲得的三維結構，（β/α）8-TIM桶狀結構（見圖1）是GH5、GH26、GH113β-甘露聚糖酶共同具有的催化域結構，由8個α螺旋和8個β折疊交替組成[22]。GH134家族β-甘露聚糖酶的三維結構與上述三個家族不同，其結構類似于卵清溶菌酶結構。

圖1 （β/α）8-TIM桶狀結構Fig.1 Barrel structure of(β/α)8-TIM

催化域結構的分子表面具有一個裂縫狀的凹槽，其內部結構具有催化活性。有8個空間位置和功能方面十分保守的位點，分別是Arg、His、Asn、Glu、His、Tyr、Glu、Trp，對酶催化活性的作用特別重要，β-甘露聚糖酶的活性口袋就是由它們共同構成的[23]。兩個Glu殘基在所有β-甘露聚糖酶分子中是絕對保守的催化基團并且在催化過程中充當活性基團，其分別是起酸堿催化和親核催化的作用。在活性位點周圍還存在與底物結合的其他保守氨基酸。

4 β-甘露聚糖酶的催化機制

β-甘露聚糖酶是內切糖苷水解酶，其水解甘露糖骨架的β-1,4-D-甘露糖苷鍵。作用方式和在底物水解中獲得的產物通常隨酶和底物的來源而變化。例如，底物中葡萄糖和α-半乳糖的位置和含量以及酯酰化程度將影響水解模式和水解程度。結晶、不溶的甘露聚糖不易降解，說明底物自身的物理狀態對此作用也會有影響。另外，不同的β-甘露聚糖酶對待水解的底物具有不同的要求。例如，源自瓜爾豆膠種子的β-甘露聚糖酶在底物中需要最少量的連續甘露糖殘基為5個，酶的結合位點主要在甘露聚糖主鏈的甘露糖基上的第六位自由羥基而來源于黑曲霉的則要求底物中連續殘基的個數最少為4[24]。甘露聚糖主要是雜多糖，它們的降解產物隨著糖鏈和結構的復雜性而變化。通過β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖后，分析該產物主要是聚合度為2～10的寡糖，產生很少或不產生單糖，酶和底物的來源對產物的聚合度有影響。研究表明，一些β-甘露聚糖酶也可以進行轉糖苷基反應，這可能是β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖獲得的大多數產品是低聚糖，沒有單糖或少量單糖的原因。如GUBITZ G M等[25]以Sclerotium rolfsii來源的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖，產物中主要包括二糖和三糖等低聚糖，當β-甘露聚糖酶作用于甘露糖四糖和甘露糖單糖（C14標記）時，發現甘露糖單糖與甘露寡糖結合；如果底物是甘露糖四糖和半乳糖單糖（C14標記），則產物主要是α-1,6-D半乳糖-β-甘露糖三糖。

β-甘露聚糖酶的催化機理與其他糖苷水解酶相似，基本上屬于雙取代反應機理[26]。這兩個谷氨酸殘基在催化反應中起重要作用，它們分別是酸堿催化基團和親核催化基團。谷氨酸的α-羧基作為親核催化基團，攻擊底物中的異構碳原子以形成共價中間體以裂解糖苷鍵；另一個谷氨酸作為酸堿催化基團，首先α-羧基提供酸催化以提供質子穩定化，然后共價中間體提供堿催化，使水分子去質子化，最終完成水解過程，具體過程見圖2[27-28]。

圖2 β-糖苷水解酶雙取代催化機制Fig.2 Disubstituted catalytic mechanism of β-glycoside hydrolase

GH134家族的β-甘露聚糖酶遵循立體翻轉機制（www.cazypedia.org）[27]。質子化的Glu45作為廣義酸起作用，為過渡態底物提供質子，使Asp57去質子化，作為產生去質子化的通用堿基，去質子化的水充當親核攻擊底物。與雙取代機制相比，立體轉換機制一步完成水解過程并改變異構體的構型，具體催化機制見圖3[28-30]。

圖3 β-糖苷水解酶翻轉催化機制Fig.3 Inverting catalytic mechanism of β-glycoside hydrolase

5 β-甘露聚糖酶的應用

由于β-甘露聚糖酶對底物種類的作用特別廣泛，所以β-甘露聚糖酶用途廣泛。

在生物技術方面，在自然界許多多糖結構復雜，而β-甘露聚糖酶可以作用于β-甘露聚糖的糖苷鍵，然后根據酶解產物中物質的種類和比例進行測定，再反向推斷多糖的部分或全部結構。因此可以作為分析天然多糖的工具酶。

在造紙工業中，與β-木聚糖酶等半纖維素降解酶組合，可以從紙漿中除去半纖維素并改善紙張質量。研究發現β-甘露聚糖酶和木聚糖酶在紙漿漂白時有協同作用，同時使用可使漂白效果大幅提升同時減少了因為堿的使用而造成對環境的污染，保護了生態環境[31]。

在環境治理方面，減少環境中的β-甘露聚糖物質可以降低消化道內容物的粘度，減少糞便排泄，減少環境污染[20，31]，還可以吸附霉菌毒素，減少抗生素和其他化學藥物的使用。

在紡織行業，苧麻作為紡織原料由來已久，但其中的膠質必須去掉，而傳統的脫膠需要高溫、高壓、強酸、強堿等條件，這不僅使得纖維遭到損壞，也對環境造成了極大的污染。而β-甘露聚糖酶對于脫膠具有特異性，使得苧麻脫膠徹底、對纖維素損壞小、提高了纖維品質。另外，β-甘露聚糖酶可有效去除附著在紡織品上的多余染料，這樣氯和堿的用量就會減少，保護了生態環境；此外，在紡織品的加工過程中，β-甘露聚糖酶還可以對布料進行軟化、打磨、拋光，進一步提高紡織品質。

在飼料工業中，谷物及其副產品中普遍存在著一種抗營養因子β-D-甘露聚糖，其在單胃動物的消化道內形成凝膠狀，使其消化道內容物具有較強的黏性，且由于家禽和豬等單胃動物，體內不能產生甘露聚糖酶和木聚糖酶等，而很多用作飼料的植物組織含有木聚糖和甘露聚糖等半纖維素，這使得動物飼料造成了極大的浪費。而甘露聚糖酶起到消除抗營養因子的作用，促進畜禽生長，減少養殖污染[32-33]；另一方面，β-甘露聚糖酶水解產生的甘露寡糖可以起到益生元的作用，調節腸道微生態平衡，抑制有害菌的生長，促進有益菌的生長。

在農業生產中，甘露聚糖類物質作為半纖維素的第二大組分，廣泛分布于自然界中，它是所有豆科植物細胞壁的主要組成成分。消除富含葡萄糖的β-甘露聚糖對豆類的干擾，提高豆粕的能量轉化率[34-35]。

在制藥行業，甘露低聚糖是一種水溶性的膳食纖維，能夠降低血清中膽固醇和甘油三酯的含量。甘露低聚糖是雙歧桿菌的增殖因子，能夠調節腸道消化系統功能，改善腸道菌群結構，故甘露低聚糖具有保護肝臟、提高免疫力、促進腸道蠕動、降低膽固醇等生理功能；此外，β-甘露聚糖酶水解富含有甘露聚糖植物膠而成的甘露糖可用于治療尿路感染。

在食品行業，β-甘露聚糖酶具有降解植物膠生成甘露低聚糖，作為益生元可有效降低人體膽固醇和血糖水平，增強人體免疫力和促進人體腸道益生菌的生長。還可以降解咖啡豆中的甘露聚糖，避免凍干過程中凝膠的形成，以利于甘露聚糖的充分利用，提高咖啡質量。同時，β-甘露聚糖酶在椰油的提取、增稠劑降解及果汁澄清等加工過程中也有重要作用。此外，甘露糖也有甜味可以替代蔗糖作為食品甜味劑。

除此之外，β-甘露聚糖酶在洗滌肥皂業、油氣開采業、及生物質燃料等行業也有重要作用。

6 展望

微生物β-甘露聚糖酶的研究近年來取得了很大進展，已經可以進行工業化量產。但能夠集大規模工業化生產，環境適應性強，活性高的的高品質β-甘露聚糖酶仍是當前之急需。基于此，不斷提高微生物酶生產水平，研究β-甘露聚糖酶的分子結構及合成的調控機制，克隆和酶基因的高效表達，新型甘露聚糖酶的開發，促進工業應用是未來努力的主要方向。