中草藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激虹鱒部分生化指標(biāo)及激素水平的影響

馮淇元 ，線婷 ，王荻 ，劉紅柏

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081）

虹鱒Oncorhynchus mykiss生長(zhǎng)適宜水溫為12～18℃，最適水溫為16～18℃，低于8℃或高于20℃時(shí)食欲減退、停止攝食，尤其在高溫環(huán)境下耐受性低、敏感度高，為典型冷水魚(yú)類[1,2]。

溫度是影響水產(chǎn)生物生長(zhǎng)、代謝和發(fā)育的重要環(huán)境因子。虹鱒作為變溫動(dòng)物對(duì)水溫的變化較為敏感，雖然其可適應(yīng)一定變溫環(huán)境，但卻存在承受范圍，超出范圍就會(huì)造成魚(yú)體損傷甚至死亡，嚴(yán)重制約虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。當(dāng)機(jī)體受到高溫刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)激反應(yīng)，非特異性免疫指標(biāo)、應(yīng)激蛋白和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[4-11]。隨著全球變暖，水產(chǎn)動(dòng)物熱應(yīng)激現(xiàn)象頻繁產(chǎn)生。為改善熱應(yīng)激阻礙虹鱒健康養(yǎng)殖的發(fā)展，從天然、毒副作用小、可替代抗生素的中草藥入手不失為一種突破壁壘的途徑[12,13]。中草藥含有維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物堿、多糖以及多種免疫活性物質(zhì)，可使魚(yú)抗熱應(yīng)激[14-17]。管標(biāo)、何福林等[18,19]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可使虹鱒生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，如肝臟組織受損等。孫裔雷等[20]在飼料中添加茵陳等復(fù)方制劑，改善了虹鱒肝、脾及腎臟中酶活性，有效提高了虹鱒的抗氧化能力。但是，關(guān)于柴胡、藿香及茵陳對(duì)魚(yú)類熱應(yīng)激免疫機(jī)能的研究較少。馬愛(ài)敏等[21]研究了柴胡對(duì)美國(guó)紅魚(yú)Sciaenops ocellatus免疫的影響，發(fā)現(xiàn)投喂含有2%柴胡的配合飼料28d后，提高了美國(guó)紅魚(yú)對(duì)哈維氏弧菌的免疫保護(hù)率，即有促進(jìn)美國(guó)紅魚(yú)免疫功能的作用。

魚(yú)類非特異性免疫系統(tǒng)在應(yīng)激環(huán)境中起重要作用[22]。魚(yú)類的營(yíng)養(yǎng)狀況、代謝水平和疾病等與其血液有密不可分的關(guān)系，當(dāng)魚(yú)體受到溫度、密度、光照等環(huán)境因子脅迫時(shí)，其生理及病理會(huì)改變，通過(guò)血液指標(biāo)體現(xiàn)出來(lái)[23,24]。本實(shí)驗(yàn)所選取的柴胡、茵陳、藿香三種中草藥[25]具有一定的抗應(yīng)激和免疫促進(jìn)作用，但其機(jī)理和藥理均有不同，通過(guò)研究虹鱒熱應(yīng)激下相關(guān)激素、酶及組織結(jié)構(gòu)的變化，可以反映中草藥對(duì)虹鱒熱應(yīng)激過(guò)程的影響，為中草藥對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物熱應(yīng)激方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用健康非免疫虹鱒200尾，平均體質(zhì)量（30±5）g，來(lái)自遼寧省本溪市某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用中草藥均購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市寶豐醫(yī)藥，研磨充分后備用；皮質(zhì)醇（COR）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、魚(yú)腎上腺素（E）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）試劑盒和堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為常溫對(duì)照組、變溫對(duì)照組、變溫柴胡組、變溫藿香組及變溫茵陳組。在基礎(chǔ)飼料中分別添加柴胡、藿香和茵陳。每組20尾魚(yú)，設(shè)兩個(gè)平行。

1.2.2 藥餌的制備

實(shí)驗(yàn)用中草藥添加劑量參照中藥大辭典等醫(yī)藥書(shū)籍給出的劑量[25]，換算成魚(yú)體質(zhì)量的添加劑量：茵陳（高濃度組30g/50kg體質(zhì)量，低濃度組20g/50kg體質(zhì)量）、藿香（高濃度組15g/50kg體質(zhì)量，低濃度組9g/50kg體質(zhì)量）、柴胡（高濃度組18g/50kg體質(zhì)量，低濃度組12g/50kg體質(zhì)量）。

準(zhǔn)確稱取三種中草藥放入各砂鍋中，參照王荻等[17]的方法制備藥汁，按各自添加量均勻噴灑藥汁于飼料表面后陰干，將制備好的飼料存放于4℃冰箱備用。

1.2.3 熱應(yīng)激處理及樣品采集

虹鱒在室內(nèi)循環(huán)水族箱（0.90m×0.50m×0.45m）中暫養(yǎng)15d，期間按照魚(yú)體質(zhì)量的3%日投喂全價(jià)基礎(chǔ)飼料。暫養(yǎng)后，柴胡組、藿香組及茵陳組按照3%的日投餌率投喂藥餌，常溫對(duì)照組及升溫對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料。

樣本一：在15℃水溫下連續(xù)投喂7d，停食1d后采集樣。

樣本二：從樣本一時(shí)間點(diǎn)緩慢升溫至20℃，采集樣本。

樣本三：持續(xù)投喂5d，停食1d，采集樣本。

樣本四：從樣本三的時(shí)間點(diǎn)緩慢升溫至25℃，采集樣本。

樣本五：持續(xù)投喂3d（期間試驗(yàn)魚(yú)已開(kāi)始出現(xiàn)死亡），停食1d，采集樣本。

用經(jīng)0.3g/100mL的肝素鈉潤(rùn)洗的2.5mL注射器采集實(shí)驗(yàn)魚(yú)尾靜脈血液。血樣轉(zhuǎn)移至離心管，在4℃下3 500r/min離心10min，吸取上層即為血漿，存于-20℃冰箱中備用。采集的虹鱒肝臟置于凍存管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ａ聿杉琪V的肝臟在波恩試液中固定，以用于制作組織切片。

1.2.4 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)魚(yú)的組織樣本與預(yù)冷的生理鹽水混合，按不同檢測(cè)指標(biāo)和試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，在冰上用高速分散勻漿機(jī)充分勻漿，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。-20℃保存的血漿水浴融化即可檢測(cè)。

按照南京建成生物工程研究所魚(yú)皮質(zhì)醇（Cortisol）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、魚(yú)腎上腺素（E）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 切片的制作與鏡檢觀察

取經(jīng)波恩試液固定后的組織，在梯度酒精和二甲苯中脫水透明后包埋、切片，蘇木精-伊紅染色（H&E），中性樹(shù)膠封片，用生物顯微鏡（Leica DM 4000 B型）進(jìn)行觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)鄧肯氏法多重比較分析組間差異顯著性，以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒血漿中皮質(zhì)醇（COR）和腎上腺素（E）含量的影響

由圖1可知，在15℃正常水溫時(shí)，三種中藥組虹鱒血漿中COR含量均高于對(duì)照組；升至20℃初時(shí)，柴胡組魚(yú)血漿中COR含量高于對(duì)照組，茵陳組魚(yú)血漿中COR含量低于對(duì)照組，而藿香高、低濃度組魚(yú)血漿COR含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。20℃持續(xù)熱應(yīng)激后，柴胡高濃度組、藿香低濃度組及茵陳低濃度組魚(yú)血漿COR含量明顯高于對(duì)照組。升溫至25℃初時(shí)，柴胡組和藿香組魚(yú)血漿COR含量明顯高于對(duì)照組，茵陳組與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。25℃持續(xù)熱應(yīng)激后，藿香低濃度及茵陳組魚(yú)血漿COR含量明顯高于對(duì)照組。在整個(gè)熱應(yīng)激期間，各中藥組魚(yú)血漿COR含量先上升后下降，但藿香及茵陳組COR含量的降幅小于柴胡組。

圖1 中草藥對(duì)熱應(yīng)激虹鱒血漿中皮質(zhì)醇（COR）含量的影響Fig.1 The effects of Chinese herbalmedicines on cortisol levels in the plasma of rainbow trout exposed to heat stress

圖2 中草藥對(duì)熱應(yīng)激虹鱒血漿中腎上腺素（E）含量的影響Fig.2 The effects of Chinese herbalmedicine on epinephrine levels in the plasma of rainbow trout exposed to heat stress

由圖2可知，在15℃正常水溫時(shí)，柴胡組、藿香低濃度組及茵陳組虹鱒血漿E含量高于對(duì)照組；升溫至20℃初時(shí)，柴胡低濃度組、茵陳高濃度組及對(duì)照組魚(yú)血漿E含量有所升高，但柴胡低濃度組和茵陳高濃度組魚(yú)血漿E含量均高于對(duì)照組。20℃持續(xù)熱應(yīng)激后，藿香組魚(yú)血漿E含量呈上升趨勢(shì)，茵陳低濃度組魚(yú)血漿E含量明顯升高，對(duì)照組魚(yú)血漿E含量呈下降趨勢(shì)。升溫至25℃初時(shí)，各組魚(yú)血漿E含量均有所升高，其中柴胡組及藿香組魚(yú)血漿E含量上升幅度明顯，且均高于同時(shí)期對(duì)照組。25℃持續(xù)熱應(yīng)激后，各組魚(yú)血漿中E含量均下降，其中柴胡組魚(yú)血漿E含量下降幅度最大，而藿香組和茵陳組魚(yú)血漿E含量仍高于對(duì)照組。

2.2 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒肝臟中酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

由圖3可知，15℃正常水溫組和升溫至20℃組相比，肝臟中ACP活性沒(méi)有明顯變化。20℃持續(xù)熱應(yīng)激后，除茵陳高濃度組外，各組肝臟ACP活性有所升高外，其余呈下降趨勢(shì)，且對(duì)照組的下降幅度最大。升溫至15℃初時(shí)，柴胡組肝臟ACP活性有所升高，茵陳高濃度組肝臟ACP活性明顯降低。25℃持續(xù)熱應(yīng)激后，柴胡組肝臟ACP活性降低，而藿香組及茵陳組肝臟ACP活性有所升高，均高于同時(shí)期對(duì)照組。

由圖4可知，15℃正常水溫組與升溫至20℃初相比，各組肝臟中ALP活性均有所降低，各組間無(wú)明顯差異。20℃持續(xù)熱應(yīng)激后，中草藥組和對(duì)照組肝臟中ALP活性均有所升高，且柴胡組和對(duì)照組升高較明顯。升溫至25℃初時(shí)，各組肝臟中ALP活性有所下降，且對(duì)照組的下降幅度最大。25℃持續(xù)熱應(yīng)激后，茵陳高濃度組肝臟ALP活性顯著高于其余各組（P＜0.05）。

2.3 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒肝臟組織變化的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)不同程度的受損，具體表現(xiàn)如下。

正常水溫15℃時(shí)：對(duì)照組和茵陳組魚(yú)肝細(xì)胞的肝索及肝血竇分布規(guī)則（圖5A，圖5D）。柴胡組和藿香組魚(yú)肝細(xì)胞、細(xì)胞核清晰完整，竇間隙分布規(guī)則（圖5B，圖5C）。各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均無(wú)實(shí)質(zhì)性肝損害。

圖3 中草藥對(duì)熱應(yīng)激虹鱒肝臟中酸性磷酸酶（ACP）活性的影響Fig.3 The effects of Chinese herbalmedicines on acid phosphatase activity in the liver of rainbow trout exposed to heat stress

圖4 中草藥對(duì)熱應(yīng)激虹鱒肝臟中堿性磷酸酶（ALP）活性的影響Fig.4 The effects of Chinese herbalmedicine on alkaline phosphatase activity in the liver of rainbow trout exposed to heat stress

初升溫到20℃時(shí)：對(duì)照組魚(yú)肝細(xì)胞排列無(wú)序，呈明顯空泡化，肝細(xì)胞萎縮，核偏移。同時(shí)，肝血竇擴(kuò)張，血細(xì)胞數(shù)目增加（圖5E）。柴胡組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，核略偏移而消失（圖5F）。藿香組魚(yú)肝細(xì)胞呈明顯空泡化，肝細(xì)胞排列無(wú)序，細(xì)胞核融合，肝血竇擁堵（圖5G）。茵陳組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且清晰，部分肝細(xì)胞核偏移，無(wú)明顯病變（圖5H）。

持續(xù)20℃熱應(yīng)激后：對(duì)照組魚(yú)肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列無(wú)序，肝血竇擴(kuò)展伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5I）。柴胡組竇間隙擴(kuò)大，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊（圖5J）。藿香組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞核偏移，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5K）。茵陳組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，肝血竇堵塞，部分肝細(xì)胞融合（圖5L）。

持續(xù)25℃熱應(yīng)激后：對(duì)照組空泡化嚴(yán)重，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞核溶解、消失（圖5M）。柴胡組呈現(xiàn)空泡化，細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞融合（圖5N）。藿香組肝血竇擴(kuò)張，部分肝細(xì)胞融合（圖5O）。茵陳組空泡化嚴(yán)重、肝細(xì)胞溶解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5P）。

3 討論

3.1 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒皮質(zhì)醇（COR）、腎上腺素（E）含量的影響

圖5 中草藥對(duì)熱應(yīng)激虹鱒肝臟組織形態(tài)的影響Fig.5 The effects of Chinese herbal medicines on liver morphology of rainbow trout under heat stress

虹鱒為典型的變溫水生動(dòng)物，水溫升高影響虹鱒血漿中皮質(zhì)醇（COR）的含量。COR為應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的一種類固醇激素，可以促進(jìn)糖原、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的分解，為機(jī)體提供更多能量，以維持正常生理機(jī)能[26,27]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)不是儲(chǔ)存COR的主要場(chǎng)所，當(dāng)熱應(yīng)激時(shí)會(huì)促使機(jī)體向血液中釋放大量COR，加快機(jī)體代謝來(lái)抵抗熱應(yīng)激。血液中COR濃度是反映魚(yú)體應(yīng)激強(qiáng)度的重要指標(biāo)[28-30]。

本研究結(jié)果顯示，在15℃正常水溫時(shí)，三種中草藥均可提高虹鱒血漿中COR含量，這為機(jī)體抵抗熱應(yīng)激提供了良好的基礎(chǔ)。水溫初升溫到20℃時(shí)，藿香促進(jìn)了機(jī)體向血漿中釋放COR的量來(lái)抵抗熱應(yīng)激，而柴胡組的作用效果次之，茵陳組血漿中COR含量低于對(duì)照。這說(shuō)明此熱應(yīng)激階段藿香組的抗應(yīng)激效果要好于柴胡組，而茵陳沒(méi)有發(fā)揮藥效。20℃持續(xù)熱應(yīng)激后，柴胡高濃度組、藿香低濃度組及茵陳低濃度組血漿中COR含量高于對(duì)照組，起到了穩(wěn)定虹鱒生理機(jī)能的作用[27]。而持續(xù)25℃熱刺激后，柴胡組、藿香高濃度組與對(duì)照組COR含量趨于一致，而藿香低濃度組、茵陳組COR含量明顯高于柴胡組和對(duì)照組，這說(shuō)明藿香低濃度組及茵陳組在25℃持續(xù)熱應(yīng)激期間仍能發(fā)揮良好的抵抗熱應(yīng)激的作用。

腎上腺素（E）作為一種激素和神經(jīng)傳送體，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)降解間接起到增多蛋白質(zhì)合成量的作用[31]，供給機(jī)體更多的能量。有報(bào)道稱，當(dāng)魚(yú)類受到熱應(yīng)激刺激后，魚(yú)體第一時(shí)間出現(xiàn)交感-嗜鉻組織系統(tǒng)反應(yīng)，血液中腎上腺素含量升高[32]。

本研究表明，在升溫至20℃初的過(guò)程中，柴胡低濃度組及茵陳高濃度組均提高了機(jī)體E含量，供給機(jī)體更多的能量來(lái)參與抵抗熱應(yīng)激，維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)。當(dāng)20℃的水溫持續(xù)刺激后，對(duì)照組魚(yú)的E含量顯著降低（P＜0.05），而各中草藥組魚(yú)仍可維持E含量穩(wěn)中有升；藿香組及茵陳低濃度組魚(yú)血漿中E含量上升幅度更大。說(shuō)明機(jī)體自身合成的腎上腺素含量不足以供給機(jī)體抵抗20℃的熱應(yīng)激，而藿香和茵陳組能有效促進(jìn)機(jī)體生成更多的腎上腺素來(lái)提供能量。25℃持續(xù)熱刺激后，機(jī)體激素水平趨于穩(wěn)定，藿香組和茵陳組魚(yú)血漿中E含量均高于對(duì)照組，說(shuō)明藿香和茵陳比對(duì)照組仍能保持機(jī)體腎上腺素的較高水平，有助于機(jī)體在熱應(yīng)激環(huán)境中維持穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)中藿香、茵陳能提高腎上腺素含量。

3.2 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

魚(yú)類處于應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)改變一些酶活性，調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝，以抵抗應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷。酶活性高低與組織器官的代謝水平及功能相關(guān)，而機(jī)體適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境的能力取決于各組織器官的健康水平，其中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）即為兩種重要的調(diào)節(jié)酶。ACP活性高低與核酸和蛋白質(zhì)的組織退變代謝有關(guān)，ACP活性增強(qiáng)時(shí)機(jī)體核酸和蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)也增強(qiáng)[33]。ACP還可以參與磷酸酯的代謝、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，在疾病免疫、細(xì)胞損傷與修復(fù)等具有一定作用[34]。因此，ACP活性高低可以反應(yīng)魚(yú)類抵抗應(yīng)激能力的強(qiáng)弱。

本研究中，在15℃正常水溫下，除茵陳高濃度組外，三種中草藥組虹鱒肝臟中ACP活性均低于對(duì)照組，初升溫至20℃時(shí)，柴胡低濃度組、藿香低濃度組、茵陳低濃度組ACP呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照組肝臟中ACP活性下降明顯。這說(shuō)明溫度的升高導(dǎo)致對(duì)照組不能夠維持機(jī)體正常酶活性，而各中草藥組起到了穩(wěn)定機(jī)體酶活性的作用。20℃持續(xù)熱刺激后，茵陳高濃度組ACP活性與其余各組明顯不同。但升溫至25℃初時(shí)，茵陳高濃度組ACP活性有所降低，而柴胡組和藿香組呈上升趨勢(shì)，且25℃持續(xù)熱應(yīng)激后，藿香組肝臟中ACP仍保持較高活性，說(shuō)明藿香提高虹鱒肝臟中ACP活性的效果較好。

ALP為溶酶體的重要組成部分，不僅參與魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育，加速物質(zhì)的吸收和利用，還可以為ADP磷酸化為ATP提供更多的無(wú)機(jī)磷，為抵抗不利環(huán)境提供機(jī)體所需能量。因此魚(yú)類應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激時(shí)其ALP可以作為重要的考察指標(biāo)。本研究中，在15℃至升溫到25℃初期，對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組ALP活性基本維持在較低水平，在持續(xù)20℃熱刺激后有小幅度升高，但沒(méi)有明顯的變化規(guī)律。而持續(xù)25℃熱應(yīng)激一段時(shí)間后，茵陳高濃度組ALP活性與其余各組形成顯著性差異（P＜0.05），而其余中草藥組魚(yú)肝臟中ALP活性仍無(wú)明顯變化。這可能是由于ALP活性偏低有助于組織細(xì)胞生理活動(dòng)處于較低水平，以適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境[34]。熱應(yīng)激期間，藿香組相比其余各組肝臟中ALP活性更穩(wěn)定。

3.3 柴胡、藿香及茵陳對(duì)熱應(yīng)激下虹鱒肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，對(duì)照組魚(yú)肝臟隨水溫升高受損嚴(yán)重，而中草藥對(duì)肝臟損傷起到一定的緩解作用。15℃正常水溫時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組虹鱒肝細(xì)胞分布均勻，肝板排列整齊，虹鱒在此水溫下代謝正常、生存狀況良好；對(duì)照組和中草藥組均未出現(xiàn)病理現(xiàn)象，其中藿香組15℃正常水溫下的肝細(xì)胞相比其余各組結(jié)構(gòu)更清晰完整。而本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組及茵陳組在15℃條件下肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，這與黃步敏等[35]得到的結(jié)構(gòu)相似，虹鱒肝小葉間結(jié)締組織與哺乳動(dòng)物不同，故肝小葉分界不明顯。之前的研究結(jié)果顯示，熱應(yīng)激可導(dǎo)致虹鱒肝臟組織結(jié)構(gòu)受損[10,36]。周彥靜等[11]對(duì)虹鱒進(jìn)行持續(xù)熱應(yīng)激，其肝臟組織結(jié)構(gòu)變化；當(dāng)水溫達(dá)到21℃時(shí)，肝臟輕微淤血，肝細(xì)胞輕度變性，但肝臟結(jié)構(gòu)仍然完整清晰。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，20℃持續(xù)熱應(yīng)激一段時(shí)間后，對(duì)照組肝血竇擁堵，肝板排列紊亂，肝細(xì)胞空泡化，各中草藥組出現(xiàn)輕微病變，如輕微淤血，細(xì)胞變性等。說(shuō)明機(jī)體對(duì)水溫升高做出了反應(yīng)，但20℃的水溫并未對(duì)中草藥組肝臟組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，說(shuō)明中草藥組可以維持機(jī)體肝臟部分結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，起到一定程度抗熱應(yīng)激作用。崔彥婷[37]研究了不同濃度大黃素對(duì)熱應(yīng)激草魚(yú)肝細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)0.04μg/mL大黃素濃度組細(xì)胞活力顯著高于高溫應(yīng)激組（P＜0.05）,保護(hù)免受氧自由基的損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡，對(duì)熱應(yīng)激起到一定抵抗作用。本研究中，25℃熱應(yīng)激情況下，對(duì)照組空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞變性程度不斷加深，肝細(xì)胞壞死凋亡，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等。茵陳組魚(yú)大面積肝細(xì)胞凋亡壞死，肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重。而柴胡組和藿香組出現(xiàn)輕微肝細(xì)胞空泡化，肝血竇擴(kuò)張、擁堵，肝細(xì)胞融合，細(xì)胞核溶解等現(xiàn)象。這與周彥靜在高溫應(yīng)激時(shí)的結(jié)果相吻合[11]。整體而言，藿香組魚(yú)肝臟在25℃持續(xù)熱應(yīng)激時(shí)的破壞程度最小，說(shuō)明飼料中添加藿香能提高虹鱒抗熱應(yīng)激損傷的能力。

3.4 小結(jié)

魚(yú)用中草藥的劑量選擇是根據(jù)中藥藥典中各藥物的常用量，因藥物和復(fù)方不同而異。目前沒(méi)有魚(yú)的常用量，以人的常用量為標(biāo)準(zhǔn)，除以平均體質(zhì)量，得到的適宜應(yīng)用量[25,38]。在水產(chǎn)中的應(yīng)用和試驗(yàn)研究證明，基本適用于部分魚(yú)類，包括虹鱒[20]。

本研究中，在熱應(yīng)激期間，藿香和茵陳組的激素和酶活性整體高于對(duì)照組，而柴胡組雖能提高機(jī)體抗熱應(yīng)激能力，但作用效果不理想，其劑量有待進(jìn)一步研究。結(jié)合組織學(xué)結(jié)果表明，藿香組緩解熱應(yīng)激的肝損傷的效果更好，可作為虹鱒抗熱應(yīng)激中草藥的備選藥物。