納米銀對銅綠假單胞菌及希瓦氏菌的抗性實驗

劉奇杰

摘 要：目的：研究納米銀和對特定菌種的抗菌性能，闡述了納米銀和納米纖維抗菌作用效果。方法：（1）微生物培養實驗，采用瓊脂培養基，在生化培養箱內培養18-24h，然后在顯微鏡下觀察微生物的菌落形貌及特點;（2）抗菌實驗，主要采用納米銀對銅綠假單胞菌和希瓦氏菌分別作用，研究納米銀存在的情況下，瓊脂培養基上銅綠假單胞菌的生長情況，同時通過顯微鏡觀察細菌的破損情況。結果：濃度越高的納米銀溶液所得抑菌環直徑越大，與納米纖維相比抑菌效果更好。結論：納米銀對于銅綠假單胞菌和希瓦氏菌都具有較強的抑制作用。

關鍵詞：納米銀;細菌培養;抗菌實驗

中圖分類號：Q2-33 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）06-0246-02

0 引言

近年來，由細菌和病毒感染引起的發病率和死亡率普遍增加，患者只能采取強化治療，包括使用廣譜抗生素或藥物。尋找新型抗菌物成為新時代的新問題。銅綠假單胞菌是醫院感染的常見病原體，屬于革蘭氏陰性非發酵桿菌。在球桿或線的形狀中沒有固定的形狀，并且有時它成對或短鏈排列。在細胞的一端存在單個鞭毛，并且在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察細菌的移動。生長溫度范圍25-42℃，最適生長溫度為25-30℃。[1]由于銅綠假單胞菌屬于傷口部位常見感染細菌，廣泛存在于環境以及正常人的呼吸道等處，該菌株具有多種天然和獲得性多藥耐藥機制。[2]希瓦氏菌（Shewanella）是一種革蘭氏陰性細菌，兼性厭氧，具單一極生鞭毛，DNA的G+C含量為43～55mol%， Baumann等人于1972年將其歸至交替單胞菌屬（Al- teromonas）。希瓦氏菌是人和水產動物的潛在病原，主要是腐敗功能，給人類健康和水產養殖造成威脅。因此研究如何殺滅這兩種細菌，具有重要意義。

銀離子的殺菌作用自古以來就是眾所周知的。而銀離子的化學性質不穩定，影響其在抗菌中的應用。有效的抗菌性能導致所用銀量的顯著減少，這保證了納米銀作為抗菌劑的成本和安全性。[3]試用納米銀作為假單胞菌和希瓦氏菌的抗菌物，為納米銀可促進人類健康生活提供依據。

1 材料與設備

1.1 材料

瓊脂粉：SIGMA;濾紙：HEPA。

1.2 設備

生化培養箱;生物安全柜：BIOBASE BSC-1500IIA2-X;顯微鏡：MOTIC DMBA210;掃描電子顯微鏡：TESCAN;電子秤：METTLLER TOLEDO AB104-N;高壓滅菌鍋：BOXUN。

2 實驗方法

2.1 培養基的制備

配置培養基供細菌生存，十組培養基大約所需1000毫升的水和28克的瓊脂粉。使用電子秤稱量28g瓊脂粉，用量筒量取1000ml水，將二者在錐形瓶中混合并用電磁攪拌機攪拌均勻。將制好的溶液放入高壓滅菌鍋滅菌，等其達到121度時關閉蒸汽閥，等待溫度下降后，取出溶液。將溶液倒入備好的培養皿中（該過程在生物安全柜中進行），待瓊脂冷卻凝固。

2.2 微生物培養實驗

采用瓊脂培養基，在生化培養箱內培養18-24h后在培養基表面蘸取一些菌群浸入溶液中，將希瓦氏菌和銅綠假單胞菌的溶液稀釋，分別用滴管取一滴置于已備好的載玻片上，蓋上蓋玻片，然后在光學顯微鏡下觀察微生物的菌落形貌及特點。

2.3 納米銀對希瓦氏菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀釋的希瓦氏菌液均勻涂抹到備好的瓊脂培養基上。將接種好的培養基至于生物安全柜中保存。再在接種好的培養皿上放置剪好的濾紙圓片（10-20mm），取三種不同濃度0.5*107particles/ml、1.5* 107particles/ml、2.0*107particles/ml的納米銀溶液各2μl分別滴到三個濾紙圓片上，這三組與未滴加納米銀的對照組一同放入生化培養箱內培養，控制溫度在33度左右大約24h后觀察實驗結果。

2.4 納米銀對銅綠假單胞菌的抗性研究

取5μl（10000 CUF/ml）已稀釋的銅綠假單胞菌接種在瓊脂培養基上至于生物安全柜中保存。再接種好的培養皿上放置剪好的濾紙圓片（直徑10-20mm），取三種不同濃度0.5*107particles/ml、1.5*107particles/ml、2.0*107particles/ml的納米銀溶液各3μl分別滴加在三個濾紙圓片上，這三組與未滴加納米銀的對照組一同放入生化培養箱內培養，控制溫度在33度左右大約24h后觀察實驗結果。

2.5 比較納米銀與納米纖維對希瓦氏菌的抗菌效果

取同等大小的納米纖維與納米銀置于同一已接種好希瓦氏菌的培養基上，將該培養皿至于生化培養箱內控制一定溫度，進行細菌培養。24小時后取出觀察希瓦氏菌在培養皿上兩種抑菌環的大小。

3 結果與討論

3.1 納米銀對于對希瓦氏菌的抗性研究結果

如圖1和表1所示，濃度分別為0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml的納米銀溶液培養的錫瓦氏菌的培養基上出現的抑菌環從無到有，并且直徑隨濃度增大而增大。說明納米銀其濃度越高對希瓦氏菌的抗性越強。

3.2 納米銀對于假單胞菌的抗性研究結果

如圖2和表2所示，濃度分別為0、0.5*107、1.5*107、2.0* 107particles/ml 的納米銀溶液培養的假單胞菌的培養基上出現的抑菌環從無到有，并且直徑隨濃度增大而增大。說明納米銀其濃度越高對假單胞菌的抗性越強。

3.3 比較納米銀與納米纖維對希瓦氏菌的抗菌效果結果

如表3實驗可觀察到納米銀產生抑菌環（直徑為2.6cm）比納米纖維產生抑菌環（直徑為1.7cm）大，由此可見納米銀比納米纖維的抗菌效果更明顯，那是什么導致納米纖維具有納米銀同樣的抗菌性但卻沒有同樣的抗菌效果呢？

Ag具有基本抗菌作用，通過圖3TiO2/Ag納米纖維的EDX可分析出Ag元素在納米纖維內占比不高，所以其抗菌效果不如純納米銀材料的抗菌效果。

通過圖4透射電鏡圖可觀察到Ag在纖維上的分布在纖維中部較稀疏在纖維邊緣有小的集中因其元素濃度較低導致抗菌效果不如納米銀抗菌效果明顯。

即Ag元素的濃度越高對菌種的抗性越強，對于Ag元素分布不均的納米纖維來說應從局部的效果考慮。

3.4 抗菌機理分析

納米級二氧化鈦具有抗菌、自潔凈功能，同時納米銀帶正電荷，與帶有負電荷的菌體蛋白質之間產生靜電吸引，從而吸附在菌體細胞膜上。納米銀與細胞壁之間發生化學作用并破壞細胞壁的完整性，在細胞壁富集電子部位表現更為明顯，導致細胞壁正常功能喪失，如營養滲透等。以大腸桿菌為對象，研究納米銀的抗菌作用，用電子顯微鏡觀察看到，納米銀作用后的大腸桿菌有明顯細胞壁破裂現象，細胞內容物釋放出來。納米銀顆粒能夠累積在細胞膜上，攻擊細胞膜磷脂雙分子層，破壞菌體細胞膜的性質，使膜的通透性發生改變，大量還原糖和蛋白質從菌體內泄漏到胞外。將大腸桿菌短期暴露在納米銀中，納米銀會導致包膜蛋白前體的積累，使菌體中五種包膜蛋白表達異常。大腸桿菌細胞膜被破壞，降低其膜電位，細胞內ATP水平降低，大量新陳代謝所必需的物質泄漏，導致了細菌的死亡。[4]

4 結論

納米銀的抗菌作用較強，濃度越高其抗菌效果越強。與納米纖維抗菌性對比其具有較強的抗菌效果，是很好的抗菌材料。納米銀作為一種新型的抗菌和殺菌材料，在普遍的抗藥菌及耐藥菌的抑制方面，具有良好的應用前景。

參考文獻

[1] 蘇甜甜.銅綠假單胞菌鞭毛及生物膜調控蛋白FleQ和糖苷水解酶Ps1G的結構與功能研究[D].2015.

[2] 何炳洪，譚妙娟，勞小斌.204株銅綠假單胞菌耐藥性分析[J].現代醫學，2012，40（4）：397-399.

[3] 曹雪玲，陸書來，張東杰，等.納米銀作為抗菌劑的抗菌性能研究[J].吉林化工學院學報，2017， 34（11）：30-34.

[4] 王燕，秦社宣，邵永珍，et al.納米銀體外對三種微生物的抑制作用及機制[J].中國微生態學雜志，2018.