江南油杉花粉離體萌發的適宜條件與萌發特征

（廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西優良用材林資源培育重點實驗室國家林業和草原局中南速生材繁育重點實驗室，南寧 530002）

江南油杉（Keteleeria fortuneivar.cyclolepis）屬松科（Pinaceae）油杉屬，為我國特有常綠喬木，是山地造林、用材林和園林綠化的理想樹種。現塊狀分布或散生于江西、湖南、廣東、廣西、貴州、云南、福建、浙江等地，常在海拔1 km 以下的丘陵和低山的陽坡地帶生長良好[1]。每年1—2月江南油杉在多年生枝條上形成花芽，3月初花粉發育成熟并開始散粉，花粉具2個氣囊，風媒傳粉[2]。

花粉活力對植物果實的授粉和受精、種子產量和質量有直接影響，主要受植物自身遺傳特性與外界因素的影響，尤其易受溫度影響[3-5]。研究花粉的離體萌發特性，確定最佳培養基組分，可以揭示花粉的生殖細胞和營養細胞發育及花粉管的生長過程，對于植物雜交育種也具有重要的現實意義[6-8]。近年來的野外觀察發現，江南油杉在傳粉時極易受雨季影響，致使大量球果授粉不足，進而導致種子敗育率高、質量較低。本研究通過花粉離體萌發對江南油杉的花粉萌發特性進行研究，對其花粉活力進行快速檢測，并了解其花粉管生長發育過程，旨在找出適合江南油杉花粉萌發的最佳培養基配方，為解決球果授粉不足問題及開展種質資源保存與人工授粉提供基礎數據，也為裸子植物孢粉學研究積累有用的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需的江南油杉花粉采自廣西南丹縣里湖鄉麻風寨（107°28'E，25°07'N）保存良好的天然林。于2018年3月初，采集發育正常尚未散粉的江南油杉雄球花，帶回實驗室后用鑷子剝下小孢子葉球，放入鋪有硫酸紙的培養皿中，置于25℃培養箱內散粉24 h，后收集花粉，置于-20℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的離體萌發

采用液體培養法對江南油杉花粉進行離體萌發試驗，通過單因素試驗設計分別對培養基蔗糖濃度、硼酸（H3BO3）濃度、氯化鈣（CaCl2）濃度、pH 值以及培養溫度進行研究。其中，蔗糖濃度試驗的培養基為150 mg/L H3BO3+ 150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250、300、350和400 g/L 蔗糖，共9個處理。H3BO3濃度試驗的培養基為最適蔗糖濃度+150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別 添 加0、50、100、150、200、250和300 mg/L H3BO3，共7個處理。CaCl2濃度試驗的培養基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250和300 mg/L CaCl2，共7個處理。pH 值試驗的培養基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+最適CaCl2濃度，pH 值分別設置為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，共5個處理。培養基試驗均在25℃條件下100 r/min 振蕩光照培養。以篩選獲得的最佳組分配制培養基，分別設置15、20、25、30和35℃培養溫度，共5個處理，100 r/min 振蕩光照培養。所有試驗總計33個處理，每處理稱取5 mg 江南油杉花粉置于1 mL 培養基中，重復3次。

1.2.2 花粉萌發率與花粉管長度觀測

江南油杉花粉在吸水24 h 后才能逐漸萌發，因此，各處理分別培養48、72和96 h后從培養基取樣，在OlympusCX-41 型光學顯微鏡下觀測記錄，每處理的每個重復隨機觀察5個視野，計算花粉萌發率，花粉管長度大于花粉粒體寬視為萌發。花粉萌發率=(萌發花粉數/花粉粒總數）× 100%。隨機選取萌發的花粉測量花粉管長度，每處理的每個重復隨機測量30個花粉管長度。

1.3 數據處理

采用Excel 2016對花粉萌發率和花粉管長度進行常規統計和制圖。采用SPSS 19.0對各試驗處理間花粉萌發率和花粉管長度進行方差分析和多重比較（鄧肯氏新復極差法）。

2 結果與分析

2.1 蔗糖濃度對花粉離體萌發的影響

不同蔗糖濃度處理，江南油杉花粉萌發率和花粉管長度存在極顯著差異（P＜0.01）。在無蔗糖的培養基（0 g/L）中，雖然花粉也可萌發，但萌發率顯著低于100～300 g/L 濃度下花粉的萌發率（P＜0.05），花粉管長度顯著低于50～300 g/L 濃度下花粉管長度（P＜0.05）（表1）。3個時段，花粉萌發率和花粉管長度均隨蔗糖濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養48 h，花粉萌發率在250 g/L 濃度下達到最大（17.5%），花粉管長度在200 g/L 濃度下最長（89.4 μm）；培養72和96 h，花粉萌發率和花粉管長度均在250 g/L 濃度下達到最大，分別為24.4%、141.3 μm和32.2%、210.8 μm。250 g/L 蔗糖較適合江南油杉花粉萌發。

2.2 H3BO3濃度對花粉離體萌發的影響

不同H3BO3濃度處理，江南油杉花粉萌發率和花粉管長度存在極顯著差異（P＜0.01）。3個時段，花粉萌發率和花粉管長度均隨H3BO3濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養48 h，花粉萌發率和花粉管長度均在200 mg/L 濃度下達到高峰，分別為14.8%和82.9 μm；培養72和96 h，花粉萌發率均在200 mg/L 濃度下達到高峰，分別為26.8%和36.1%，花粉管長度均在250 mg/L 濃度下達到高峰，分別為150.4和218.4 μm，但與200 mg/L 濃度下花粉管長度差異不顯著（表2）。200 mg/L H3BO3較適合江南油杉花粉萌發。

表1 蔗糖濃度對江南油杉花粉萌發率和花粉管長度的影響Tab.1 Effects of sucrose concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

表2 H3BO3濃度對江南油杉花粉萌發率和花粉管長度的影響Tab.2 Effects of H3BO3 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.3 CaCl2濃度對花粉離體萌發的影響

3個時段，江南油杉花粉萌發率和花粉管長度均隨CaCl2濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養48 h，花粉萌發率和花粉管長度均在100 mg/L濃度下達到高峰，分別為18.7%和81.9 μm；培養72和96 h，花粉萌發率均在100 mg/L 濃度下達到高峰，分別為32.3%和41.3%，花粉管長度均在150 mg/L濃度達到高峰，分別為151.4和215.3 μm，但與100 mg/L 濃度下花粉管長度差異不顯著（表3）。100 mg/L CaCl2較適合江南油杉花粉萌發。

表3 CaCl2濃度對江南油杉花粉萌發率和花粉管長度的影響Tab.3 Effects of CaCl2 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.4 pH值對花粉離體萌發的影響

當培養基pH 值為5.0和5.5 時，江南油杉花粉萌發率較低，兩者差異不顯著，花粉管生長緩慢，隨著培養基pH 值升高，花粉萌發率和花粉管長度也隨之增加；當pH 值為6.5 時，3個時段花粉萌發率和花粉管長度均達到最大，之后降低（表4）。培養基pH 6.5 較適合江南油杉花粉萌發。

表4 pH值對江南油杉花粉萌發率和花粉管長度的影響Tab.4 Effects of pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.5 溫度對花粉離體萌發的影響

不同溫度處理下江南油杉花粉萌發率和花粉管長度差異顯著（P＜0.05）。在15℃處理下，花粉萌發率較低，花粉管生長緩慢；隨著溫度升高，花粉萌發率迅速升高，3個時段均在25℃最高，分別為18.5%（48 h）、33.2%（72 h）和42.1%（96 h）（圖1a）。3個時段花粉管長度隨溫度的變化規律不一致；培養48 h，花粉管長度隨溫度升高逐漸增加；培養72 h，花粉管長度隨溫度升高先增加后減小，在30℃達到最大（156.24 μm），但與25℃花粉管長度差異不顯著；培養96 h，花粉管長度隨溫度升高先增加后減小，在25℃達到最大（217.44 μm）（圖1b）。

圖1 溫度對江南油杉花粉萌發率和花粉管長度的影響Fig.1 Effects of temperatures on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

3 結論與討論

大量研究表明，在花粉離體萌發培養基中蔗糖、H3BO3和Ca2+為最常用的添加物質，其中，蔗糖既是花粉萌發和花粉管壁合成的營養物質來源，又是花粉萌發時內部代謝與跨膜運輸的碳源，維持著外界環境的滲透壓和花粉萌發形態[6，9]。Dane 等[10]研究發現花粉在離體萌發時，其自身儲存的營養物質調控著外界的蔗糖濃度。本研究結果表明，在無蔗糖培養基中江南油杉花粉仍可萌發，但萌發率和花粉管長度顯著低于添加蔗糖的培養基，可能是花粉自身儲存的營養物質為其萌發提供一定養分，但隨著營養物質逐漸消耗，花粉管生長緩慢；添加不同濃度蔗糖的培養基之間，花粉萌發率和花粉管長度差異顯著，高濃度蔗糖會抑制花粉萌發和花粉管生長，這與田菊等[11]對油松（Pinus tabuliformis）花粉離體萌發和李國平等[12]對黑松（Pinus thunbergii）花粉離體萌發的研究結果一致。

花粉離體萌發培養基中的H3BO3可引導培養基內的Ca2+進入花粉細胞內，并增加花粉細胞對糖的吸收與代謝，促進花粉萌發和花粉管生長[13-14]。Ca2+對花粉管極性生長與生長方向具有調控作用[15]。相關研究表明，H3BO3濃度和Ca2+濃度對油松[11]、黑松[12]、五針松（Pinus parviflora）、羅漢松（Podocarpus macro?phyllus）[16]和銀杏（Ginkgo biloba）[17]等裸子植物離體花粉的萌發率和花粉管長度均表現出先促進后抑制的作用，高濃度硼酸和Ca2+會抑制花粉的萌發，與本文研究結果一致。但本研究中，培養48 h，花粉管長度在200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2處理下達到高峰，而培養72和96 h，花粉管長度均在250 mg/L H3BO3和150 mg/L CaCl2處理下達到高峰，這可能是因為在培養前期，200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2能滿足花粉管生長的需求，隨著培養時間增加需要更高的H3BO3和CaCl2濃度才能促進花粉管生長。

不同植物花粉離體培養基最佳pH 值和最適培養溫度差異較大。趙麗娟等[6]研究表明小黑楊（Pop?ulus simonii×P.nigra）花粉離體萌發的最佳pH 值為6.0，最適培養溫度為21℃；黃家興等[18]研究表明凱特杏（Prunus armeniaca‘Katy’）花粉離體萌發的最佳pH值為6.0，最適培養溫度為20℃；Kakani等[19]研究表明陸地棉（Gossypium hirsutum）花粉離體萌發的最適溫度為32℃。試驗表明，pH 值和培養溫度均對江南油杉花粉萌發影響顯著。江南油杉花粉離體培養基最適pH值為6.5，當pH值為7.0時，花粉萌發率下降，當pH 值為5.0 時，花粉萌發率極低，且花粉管生長緩慢，說明江南油杉花粉萌發需要弱酸環境，強酸可能會破壞花粉細胞內部代謝平衡[20]。江南油杉花粉萌發的最適溫度為25℃，過高或過低均會抑制其花粉萌發，25℃與江南油杉散粉期外界溫度相近，說明溫度并不是自然條件下江南油杉球果授粉不足的限制因素。

綜上所述，江南油杉花粉離體萌發最佳培養基組合和培養條件為250 g/L 蔗糖+ 200 mg/L H3BO3+100 mg/L CaCl2，pH值為6.5，置于25℃光照培養96 h時萌發率為42.4%，為進一步開展江南油杉種質資源保存和人工授粉的研究提供基礎數據。