毛殼菌來源的α-葡聚糖酶酶學性質分析及制糖生產輔料對其活性影響

黎志德，梁達奉*，張九花，黃曾慰，李雨虹

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省酶制劑與生物催化工程技術研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

α-葡聚糖酶是一種特異性水解葡聚糖 α-1,6糖苷鍵的酶。酶促反應終產物包括異麥芽寡糖和少量低聚合度的葡聚糖[1]。在制糖生產中，甘蔗或者甜菜在砍收運輸堆放過程中易發生微生物感染并產生葡聚糖，而葡聚糖的出現會對后續生產產生一系列不良影響[2]。傳統蔗汁澄清工藝對多糖類物質的清除效率并不高[3]，而 α-葡聚糖酶可以有效應對這一問題。目前α-葡聚糖酶在甘蔗亞硫酸法生產耕地白糖[4]、原糖精煉[5]以及甜菜制糖方面均有應用試驗報道。此前國內有報道指出，已對朱黃青霉來源的α-葡聚糖酶基因片段進行克隆[6]并在酵母上表達[7]，以及對其發酵產物進行進一步純化和酶學性質分析的研究[8]。此后針對制糖生產的實際條件，在適應已有設備和工藝參數的前提下，對原有的酶制劑提出了更高的要求。本文在此前研究不同基因來源的α-葡聚糖酶基本酶學性質表征的基礎上，研究甘蔗制糖生產中常見輔料對其活性的影響，為在實際生產調控時提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-葡聚糖酶凍干粉，聚丙烯酰胺 T1150：廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所)；α-葡聚糖：美國SIGMA公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸，磷酸氫二鈉，磷酸，無水亞硫酸鈉，氯化鈣，氫氧化鈉，苯酚，酒石酸鉀鈉：廣州化學試劑廠(均為分析純)。

DK-S24恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；U2800紫外-可見分光光度計，美國Unico公司；FiveEasyTMFE20 pH計電子分析天平，美國梅特勒公司。

α-葡聚糖酶基因序列來源于Chaetomium，廣州市微生物所冷凍干燥。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛殼菌屬來源α-葡聚糖酶的酶學性質

1.2.1.1 不同底物分子量對 α-葡聚糖酶反應速率的影響

選取型號 D9260、31387、09184、31392 和 D5376的 α-葡聚糖粉末，其相對分子量分別為 9000～11000、15000～25000、100000、450000～650000、1500000～2800000 g/mol。按質量體積比2.0%加入到檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.5)中，攪拌使之充分溶解，再加入經適當稀釋的酶液，測定酶活。以分子量最高的 D5376的測定值為 100%，其余折算成相對酶活。

1.2.1.2 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

選取pH 5.5，含有2.0% α-葡聚糖D5376的反應底物溶液，加入經適當稀釋的酶液，分別在35、45、55、65、75℃下反應10 min，測定酶活，以最高活性的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.3 α-葡聚糖酶的最適反應pH

配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液，0.1 mol/L檸檬酸溶液作為母液，再分別配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，再按2.0%(m/V)比例加入α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。將經適當稀釋的酶液加入到上述底物溶液中，測定酶活。以活性最高的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.4 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%(m/V)比例加入α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。將經適當稀釋的酶液加入到上述底物溶液中，測定酶活，以底物濃度2.0%(m/V)的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.5 反應時間對α-葡聚糖酶酶活測定的影響

將 α-葡聚糖酶液稀釋至適當倍數，加入到2.0%(m/V)底物溶液中，55℃水浴，分別測定反應時間為 5、10、15、30、45、60、90 min時的酶活，以反應時間為10 min的樣本為100%，其他折算成相對酶活。

1.2.2 制糖生產中加入的輔料對α-葡聚糖酶的影響

1.2.2.1 SO32-濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

據文獻數據[9]，制糖工藝中12 mL的硫熏強度相當于向每100 mL溶液里加入2.0 mL濃度為6.0%的H2SO3?，F將硫熏強度梯度定為0、9、15、21、30 mL，將最高值樣本所含的 SO2折算成等摩爾的Na2SO3，即每100 mL溶液含有0.046 g Na2SO3。取pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，分別加入對應量Na2SO3，再調整pH到5.5。最后加入2.0%的α-葡聚糖 D5376充分溶解后備用。加入 Na2SO3的底物溶液與空白底物溶液分別配制成對應硫熏強度的底物溶液，加入經適當稀釋的酶液，各組獨立空白對照，測定酶活。以空白樣本為100%對照，折算成相對酶活。

1.2.2.2 Ca2+濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

文獻[10]指出，CaO(生石灰)加入到蔗汁后會與蔗糖形成糖化鈣。實際生產時，是按0.1%～1.0%的比例將CaO加入到約13%濃度的蔗糖溶液中?，F假定鈣是完全電離，經折算后選定Ca2+濃度0.05 mol/L作為最高值。取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入CaCl2至0.05 mol/L，待充分溶解后再次將pH調整到 5.5，最后加入 2.0%的 α-葡聚糖 D5376配置成底物溶液。與不含Ca2+的一般底物溶液勾兌成含不同濃度Ca2+的底物溶液，加入經適當稀釋的酶液，各組獨立空白對照，測定酶活。以不含Ca2+的樣本為100%對照，其余折算成相對酶活。

1.2.2.3 P2O5濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

甘蔗制糖生產中一般以P2O5來衡量磷酸值，在澄清工段中，蔗汁中 P2O5的殘余總量一般不超過500 mg/L[10]。因此選擇分析樣本的P2O5濃度分別為100、200、300、400、500 mg/L。實驗中以相同摩爾數的Na2HPO4代替H3PO4，取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入對應量的Na2HPO4，然后將pH調整到5.5，再加入2.0%的α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。加入經適當稀釋的酶液，各留一組空白對照，55℃下測定酶活。以不含P2O5的樣本為100%，其余折算成相對酶活。

1.2.2.4 聚丙烯酰胺對α-葡聚糖酶活性的影響

取聚丙烯酰胺(PAM)T1150顆粒充分溶解在pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，PAM濃度為0.1%。加入2.0%的α-葡聚糖D5376攪拌使其充分溶解，與空白底物溶液勾兌成不同聚丙烯酰胺濃度。然后各組獨立空白對照，測定酶活，各組獨立空白對照。以空白樣本為100%，其余折算成相對酶活。

1.2.3 主要參數的計算方法

酶活測定按照 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[11]，用外標法得到葡萄糖標準曲線：

葡萄糖含量(mg/mL)=A×OD540nm+b。

將 0.1 mL稀釋至適當倍數的 α-葡聚糖酶液加入到0.9 mL的底物溶液當中，水浴反應10 min，加入2.0 mL DNS至溶液中反應，沸水浴5 min，定容至20 mL。

測定反應體系的 OD540nm值，按以下公式進行計算：

酶活(U/mL)=(OD540nm-b)/A×稀釋倍數×1000/180。

反應以滅活酶液作為空白校準，每次反應前，先將預處理好的酶液進行酶活測定。以起始樣本測定所得酶活為100%，然后按百分比折算各個反應后樣本的值為剩余酶活。

2 結果與分析

2.1 毛殼菌來源α-葡聚糖酶的酶學性質

2.1.1 底物分子量對α-葡聚糖酶的反應速率的影響

從表1可以觀察到α-葡聚糖酶的酶促反應效率受底物的分子量影響。當 α-葡聚糖的分子量小于100000 g/mol時，分子量較高的底物樣本單位時間內產生還原端更多，折算后的α-葡聚糖酶活性更高。在分子量大于100000 g/mol區間的數據，經方差分析P=0.085＞0.05，即樣本間差異并不顯著。根據底物分子量減少時酶促反應受分子量的變化趨勢判斷，用高分子量型號的α-葡聚糖可以使酶活測定受底物降解程度影響更少，數據更穩定。

表1 不同底物分子量對α-葡聚糖酶的反應速率的影響

2.1.2 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

圖 1實驗結果表明，α-葡聚糖酶在 55℃到 60℃的區間內酶促反應活性最高且保持平穩。當反應溫度下降到45℃或者上升到65℃時，酶的反應速率會下降約一半。溫度進一步偏離時，酶活進一步降低，且高溫區間下降速度比低溫區間要大。考慮到甘蔗制糖生產時壓榨工段有較長的停留期以及相對合適的環境溫度，還有在高濃度蔗糖條件下，酶的熱穩定性也會有明顯的增長，α-葡聚糖酶具有在多個工藝位點加入的潛力。

2.1.3 α-葡聚糖酶的最適反應pH

圖 2實驗結果表明，α-葡聚糖酶具有較好的酸堿度適應性，酶促反應活力最高點在pH 5.5上，而且在pH 4.0～7.0的區間內都有較高的活性，而此范圍與鮮榨蔗汁的常見 pH重合。但是當反應環境的pH值低于4.0或者高于pH 7.0時，酶活會大幅度降低。

2.1.4 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

圖3實驗結果表明，當底物α-葡聚糖D5376在緩沖溶液中的濃度達到2.0%(w/V)后，α-葡聚糖酶酶活變化趨于平穩，說明酶與底物的結合位點已經趨于飽和狀態，同時高分子量的葡聚糖會提高溶液粘度，不利于反應底物與產物的擴散，反而影響酶促反應的整體效率?？梢娫诖_定α-葡聚糖酶添加量時，應該綜合考慮葡聚糖含量，物料或樣本的成分與性狀，反應溫度等因素。

圖1 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

圖2 α-葡聚糖酶的最適反應pH

圖3 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

2.1.5 反應時間對α-葡聚糖酶酶活測定的影響

從圖4中可以觀察到，取樣時間越短測量折算后的酶活就越高，取樣時間5 min時折算的酶活比10 min高20%，而90 min則下降60%。此現象說明α-葡聚糖酶活性隨著反應時間的延長逐漸衰減。綜合各點數據，在pH 5.5和55℃的條件下持續反應1 h，α-葡聚糖酶仍能保持一半以上的相對酶活。因此在實際使用時，若酶加入后有較長的停留時間，可以適當減少其用量。

圖4 不同時間取樣測得的α-葡聚糖酶活性

2.2 制糖生產中加入的輔料對α-葡聚糖酶的影響

2.2.1 SO2濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

圖5實驗結果表明，溶液中SO32-濃度的增加，對α-葡聚糖酶活性的影響并不明顯。與空白對照相比，硫熏強度為9 mL的樣本酶活下降約5.3%，SO32-濃度為30 mL樣本的酶活下降幅度約14.5%，說明保持反應環境pH穩定，單一SO32-對酶的影響比較輕微。

圖5 不同SO2濃度下測得的α-葡聚糖酶活性

2.2.2 Ca2+濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

從圖6中可以觀察到，在控制溶液pH的前提下，酶活隨著Ca2+濃度的上升而逐漸降低，但幅度并不大。當Ca2+濃度在最高組的0.05 mg/mL時，酶活的下降幅度也僅為 13.4%。甘蔗制糖生產中，加入生石灰的主要目的是生成亞硫酸鈣絮狀物和調節pH。由于產生大量游離鈣離子的時間很短，對酶產生的實際影響還會進一步減弱。

2.2.3 P2O5濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

從圖7中可見，在加入的P2O5濃度上升至500 mg/L的過程中，酶活變化范圍沒有超過 5.3%，可見加入該濃度范圍內的P2O5對α-葡聚糖酶活性的影響并不明顯。在實驗過程中發現，如果直接加入H3PO4后重新調整pH到5.5，底物會發生明顯的自然降解，放置時間過程會明顯降低酶活的測定值。

2.2.4 聚丙烯酰胺濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

圖6 不同Ca2+濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

圖7 不同P2O5濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

圖8 實驗結果表明，聚丙烯酰胺對α-葡聚糖酶的活性影響并不大，不同濃度樣本的酶活衰減程度最大不超過 12.1%。同時，底物溶液的粘度隨著聚丙烯酰胺濃度的上升而明顯加大。

圖8 不同PAM濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

3 結論與討論

經上述研究表明，α-葡聚糖酶的最適反應條件是60℃，pH 5.5，底物濃度為2.0%。制糖生產常見的SO32-，Ca2+，P2O5和聚丙烯酰胺對酶活影響并不明顯。在實驗中，直接加入H3PO4模擬磷酸值影響測定數據的穩定性和準確性，考慮到慣用的緩沖液體系也含有一定濃度的磷酸鹽，這一問題有待進一步實驗研究。目前最大的影響因素是 pH和溫度，所以酶制劑添加點要避開預灰后和二次加熱的高pH和高溫環境。實際應用中，若是能夠控制反應環境的 pH和溫度，或是新研制耐受性更好的酶，那么α-葡聚糖酶在多個位點都有良好的預期效果。