HPLC法測定硫酸黏菌素發酵液含量方法探討

庫麗扎達·木拉提

（新疆維吾爾自治區獸藥飼料監察所，新疆 烏魯木齊 830063）

硫酸黏菌素，又稱硫酸黏桿菌素、硫酸抗敵素、克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，分子式為C52H98N16O13·2H2SO4，分子量為1352。純品為白色或類白色粉末，易溶于水。硫酸黏菌素是堿性多肽類抗生素，主要用于防治敏感菌的感染和促進畜禽生長。硫酸黏菌素可以與細胞膜脂蛋白游離磷酸鹽結合，使得細胞膜表面張力減小、通透性增加，導致胞漿外流，細胞死亡。硫酸黏菌素對革蘭氏陰性菌有強抑制作用，對革蘭氏陽性菌和真菌無作用。硫酸黏菌素發酵液毒性較低，不易造成藥物殘留，不易產生耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agi1ent1260（美國Agi1ent公司）；百萬分之一天平（Mett1er xs105）；5 mL一次性注射器。

1.1.2 試劑和試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司），乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司），水（超純水），磷酸（分析純，北京北化精細化學品有限公司），無水硫酸鈉（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；硫酸黏菌素標準品(批號為 20170314，含量為 E1：29.6%，E2：50.3%，中國獸醫藥品監察所)，硫酸黏菌素發酵液（發酵放罐樣品）：規格根據發酵液發酵的不同時段有不同的效價。

1.1.3 溶液的制備

1.1.3.1 稀磷酸（10%） 吸取7 mL磷酸到100 mL容量瓶，用水定容至刻度。

1.1.3.2 緩沖液 稱取4.46 g無水硫酸鈉，加900 mL水，用10%稀磷酸調pH至2.4，再用水定容至1 000 mL，過濾，超聲，待用。

1.1.3.3 混合溶劑 將水、乙腈按4∶1混合，過濾，超聲，待用。

1.1.4 標準品溶液

將25 mg硫酸粘菌素標準品用混合溶劑溶解并定容至50 mL，搖勻，即得硫酸粘菌素標準品溶液（0.5 mg/mL）。

1.1.5 樣品處理

取發酵放罐樣品濾液2.5 mL，置50 mL容量品中，用超純水稀釋至刻度，使用混勻機充分混勻，并使用微孔濾膜過濾。

1.2 方法

高效液相色譜法。

1.2.1 色譜條件

色譜柱為C18，4.6 mm×150 mm，3 μm，流動相為用250 mL容量瓶量取乙腈至刻度，依次用20 mL及10 mL移液管共移出乙腈30 mL，將剩余220 mL乙腈全部移至1 000 mL容量瓶中，加緩沖液至刻度后，再添加3 mL乙腈，混勻，過濾，超聲，流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，進樣量20 μL。

1.2.2 含量測定

首先進標準品溶液兩針，記錄相關峰面積，再進樣品溶液兩針，記錄相關峰面積，計算硫酸粘菌素發酵液含量（發酵120 h以上的效價，應≥12 000 μg/mL）。

2 結果與分析

2.1 計算公式

總含量（μg/mL）=E1含量+E2含量 (結果見圖 1、圖 2）

2.2 高效液相色譜圖（硫酸黏菌素標準品、樣品色譜圖）

圖1 硫酸黏菌素標準品

圖2 硫酸黏菌素發酵液樣品色譜圖

2.3 精密度試驗

取1.1.5項下硫酸黏菌素樣品溶液20 μL，按1.2.1項下色譜條件重復進6次，記錄色譜圖峰面積結果見表1。硫酸黏菌素峰面積的RSD為0.11%，表明色譜系統精密度良好。

表1 精密度試驗結果表

表2 重復性試驗結果表

2.4 重復性試驗

取按1.1.5項制備的6份供試品，按1.2.1色譜條件分析，記錄色譜圖，計算含量，平均值為10 660 μg/mL，RSD為0.18%，表明該方法中硫酸黏菌素的重復性良好，結果見表2。

3 討 論

用該方法測定硫酸黏菌素發酵液含量，同一樣品平行測定6次平均含量值為18 666.8 μg/mL，峰面積的RSD為0.11%；經測定6個樣品含量平均值為18 886.7 μg/mL；RSD為0.80%；硫酸黏菌素發酵液經過精密度試驗、重復性試驗測定結果RSD均在規定的范圍內，且有較好的準確度和精密度。

4 結 論

用HPLC法測定硫酸黏菌素發酵液含量，方法合理、操作便捷，適合于硫酸黏菌素發酵液的檢測，并控制該產品的質量，可作為硫酸黏菌素發酵液的質量標準，用于硫酸黏菌素的含量測定，以控制、保證產品質量。