新疆地區不同綿羊品種支原體肺炎血清學調查

倪文浩 ，趙亞南 ，劉宜勇 ，吐來力江·哈木太 ，艾爾肯·艾沙 ，買力肯 ，曹 妍 ，瑪依拉 ，陳 磊 *，李文蓉 *

（1.石河子大學動物科技科學院，新疆 石河子 832003；2.新疆畜牧科學院生物技術研究所，新疆 烏魯木齊 830026；3.新疆巴音郭楞蒙古自治州種畜場，新疆 博湖縣 841400；4.新疆伊犁州畜牧總站，新疆 伊寧 835000）

綿羊肺炎支原體（Mycop1asma ovipneumoniae of sheep）是引起綿羊或者山羊傳染性胸膜肺炎又叫做綿羊支原體肺炎（Mycop1asma ovipneumoniae，MO）的病原體[1]。該病原體屬于原核生物界支原體科支原體屬，1963年首次由Mackay從綿羊體內分離得到，其后Cottew也在患間質性肺炎的澳大利亞綿羊肺臟中發現該病原，1972年Carmichea1等人證明了這種支原體的致病性[2]，并命名為綿羊肺炎支原體。該病多發生在枯草的冬季和早春季節，此時羊只因營養缺乏，機體抵抗力普遍降低，容易受寒感冒，羊只因此容易患支原體肺炎，且發病后致死率也很高。由于本病感染后常呈慢性表現，羊只即使康復也可長期帶菌，造成該病的控制和消滅比較困難。近年來，隨著新疆地區舍飼生產方式推廣、集約化養殖技術廣泛應用及各種國外綿羊新品種的引進[3]，加之新疆地區氣候特點、規模化羊場因羊群高度集中飼養及羊群活動范圍限制等因素，綿羊支原體肺炎的發病率和致死率有所上升，該病已成為危害綿羊養殖業的重要因素之一，對畜牧業發展造成了巨大經濟損失。

綿羊支原體肺炎常呈現地域流行性，病原體主要通過飛沫傳播，在寒冷潮濕、雨水不斷、羊群擁擠、密集等環境因素下，對呼吸道的感染率較高[4]。1982年，胡景韶等人首次從國內發病綿羊體內分離到了該支原體，隨后寧夏和新疆等地也分離到了該病原[5]。2005年以來，陶岳等開展了對新疆北疆石河子、沙灣、昌吉、奇臺等地區綿羊肺炎支原體的血清學調查表明，綿羊肺炎支原體在上述地區廣泛存在[6-10]，嚴重影響當地養羊業健康發展。為了解近年來綿羊肺炎支原體在新疆南北疆地區不同綿羊品種中的感染情況，2018年，我們采集了新疆伊犁與巴州地區未免疫MO疫苗的4種綿羊品種血清樣本進行血清MO抗體和抗原成分的檢測及分析，為新疆地區綿羊支原體肺炎的防控提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

綿羊肺炎支原體抗體（Sheep MP Ab，以下簡稱MP-Ab）、綿羊肺炎支原體抗原（sheep MP Ag，以下簡稱MP-Ag）ELISA試劑盒購自TSZ（美國），離心機購自德國艾本德，ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司，3001-1311型酶標儀購自賽默飛世有限公司；DHP-420恒溫培養箱購自北京市永光明醫療器械廠，其他所用試劑耗材（如采血管等）均為國產試劑。

1.2 血樣收集與處理

2018年4月至5月在新疆伊犁和巴州地區兩個規模化羊場，隨機采集2～3歲年齡綿羊血清，共1 628份（樣品信息參見表1）。使用非抗凝真空采血管采集新鮮靜脈液，于4℃冰箱靜置30 min，待其自然凝集，收集析出上清。將其中溶血現象血液樣品進行離心10 min（3 000～4 000 r/min），仔細收集上清。收集的血清進行標記、記錄羊號，而后放置-80℃冰箱保存備用。

1.3 Sheep MP抗原抗體ELISA檢測

1.3.1 Sheep MP抗體檢測

參照Sheep MP Ab試劑盒說明書進行血清MO抗體水平的定性定量分析：該試劑盒采用間接ELISA方法，用MO抗原包板。具體操作：將樣品對應微孔按序編號，每板設陰性對照2孔、陽性對照2孔。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性標準對照、陽性標準對照50 μL。然后在待檢樣品孔中依次分別加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測血清樣品。輕輕搖勻，蓋上封板膜，置于37℃溫箱培養箱孵育30 min。隨后揭開封板膜，甩干液體，拍干后用30倍稀釋的洗液洗滌，重復洗滌5次。加入酶標二抗50 μL后，再次放置溫箱溫育30 min。孵育后的洗滌步驟同上。接著，每孔現加入顯色劑A 50 μL、再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃溫箱內避光顯色15 min。最后，每孔加入終止液50 μL，終止反應。將酶標版放置至450nm波長酶標儀中測定OD450nm值。結果判定：試驗的有效性為設置陽性對照孔平均值≥1.00，設置陰性對照平均值≤0.10；臨界值=設置陰性對照孔平均值+0.15。其中，樣品OD值＜臨界值(CUT OFF)者為綿羊肺炎支原體(MO)陰性，樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為MO陽性。

1.3.2 Sheep MP抗原檢測

參照Sheep MP Ag試劑盒說明書進行血清MO抗原水平的定性定量分析：該試劑盒采用雙抗體夾心ELISA方法，用MO抗體包板。具體操作：將樣品對應微孔按序編號，每板設陰性對照2孔、陽性對照2孔。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性標準對照、陽性標準對照抗原50 μL。然后在待檢樣品孔中依次分別加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測（抗原）血清樣品。輕輕搖勻，蓋上封板膜，置于37℃溫箱培養箱孵育30 min。隨后揭開封板膜，甩干液體，拍干后用30倍稀釋的洗液洗滌，重復洗滌5次。加入酶標抗體50 μL后，再次放置溫箱溫育30 min。孵育后的洗滌步驟同上。接著，每孔現加入顯色劑A 50 μL、再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃溫箱內避光顯色15 min。最后，每孔加入終止液50 μL，終止反應。將酶標版放置至450nm波長酶標儀中測定OD450nm值。結果判定：試驗的有效性為設置陽性對照孔平均值≥1.00，設置陰性對照平均值≤0.10；臨界值=設置陰性對照孔平均值+0.15。其中，樣品OD值＜臨界值(CUT OFF)者為綿羊肺炎支原體(MO)陰性，樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為MO陽性。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，采用卡方檢驗進行差異顯著性比較，以P＜0.05表示差異顯著，用不同小寫字母表示；以P＜0.01表示差異極顯著，用不同大寫字母表示。

2 結 果

2.1 血樣收集

采集的新疆伊犁和巴州地區規模化羊場綿羊血清共1 628份，見表1。

表1 新疆伊犁地區和巴州地區規模化羊場綿羊血清樣品情況

2.2 Sheep MP抗原、抗體ELISA檢測結果

新疆伊犁和巴州地區羊場不同綿羊品種血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA檢測結果如表2所示，不同地區綿羊品種間均檢測到MP-Ag和MP-Ab。其中，伊犁地區MP-Ag平均陽性率20.29%與MP-Ab平均陽性率16.62%均高于巴州地區MP-Ag平均陽性率14.42%與MP-Ab平均陽性率14.65%，但差異不顯著（P＞0.05)。伊犁地區哈薩克羊、薩福克羊的MP-Ag陽性率分別為20.04%、20.61%，巴州地區巴音布魯克羊、杜泊羊、薩福克羊MP-Ag陽性率分別為17.91%、11.08%、14.70%，同一地區不同綿羊品種的MP-Ag陽性率雖有差異，但差異不顯著。 伊犁地區哈薩克羊MP-Ab陽性率23.22%極顯著高于薩福克羊MPAb陽性率8.30%（P＜0.01)，巴州地區巴音布魯克羊MP-Ab陽性率18.65%顯著高于杜泊羊MP-Ab陽性率11.08%（P＜0.05），也高于薩福克羊MP-Ab陽性率13.32%，但差異不顯著（P＞0.05）。說明不同綿羊品種之間MP-Ab檢出陽性率存在差異。

表2 伊犁、巴州地區羊場不同品種綿羊血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA檢測結果

3 討 論

綿羊支原體肺炎是由肺炎支原體感染而誘發的一種急性、熱性和高度傳染性的疾病，其臨床特征是高熱、咳嗽，肺和胸膜發生漿液性及纖維素性炎癥[11]。除急性發病外，該病原可長期存在于動物體內，導致部分病羊漸進性消瘦，懷孕母羊感染還易引發流產，羔羊感染死亡率較高。綿羊肺炎支原體流行廣泛，致病力強，病羊是主要傳染源。病原體主要通過呼吸道分泌物排出體外，經空氣-飛沫傳播[12]，耐過病羊在相當長時間內帶毒，有傳播病原的危險性。由于該病對青霉素類藥物具有抗性，且容易對四環素和大環內酯類藥物產生耐藥性，所以對綿羊支原體肺炎的抗生素治療效果不佳。此外，綿羊支原體疫苗的保護作用較弱[13]，對該病的防控帶來很大困難，對養羊業危害嚴重。

綿羊肺炎支原體是國內綿羊、山羊和大角羊最常見的分離病原體之一，可引起羊的原發性非典型肺炎[14]。Rong et a1.(2014)通過綿羊肺炎支原體血清學調查研究了中國熱帶地區的山羊，檢出陽性率高達31.7%[15]，青海省（2009年）陽性率 30.40%。在本研究中，對新疆伊犁、巴州地區不同綿羊品種進行血清學檢測，調查了綿羊支原體肺炎感染情況，結果顯示綿羊支原體肺炎的總抗體陽性率平均達到15.54%。這與李劼等報道的新疆石河子地區（2005年）湖羊MO抗體陽性率 77.90%、新疆阿勒泰（2012年）陽性率22.20%相比，抗體陽性率較低。一方面，這可能是外來引進綿羊適應新疆環境的能力較弱，感染該病且發病致死率高，不同年齡的羊只感染該病的情況不同有關，本研究所涉及羊只均為2～3歲齡的成年羊。解慧梅等[16](2015)對泰州地區36家羊場開展綿羊支原體肺炎流行病學調查，得到3月齡以下的羔羊發病率為45%、致死率為95%，明顯高于其它年齡階段的羔羊、成年羊。馬玉等[17]（2015）對沙灣縣調查的7個鄉鎮的18個綿羊養殖場中，0～3月齡羔羊的臨床疑似綿羊支原體肺炎所占比例最高達68.57%，明顯高于3～12月齡（27.78%）和12月齡以上（19.66%）的綿羊。本研究的血清樣品為2～3歲齡的成年羊，其抗體檢出陽性率為8.30%～23.22%，與馬玉對沙灣縣12月齡以上綿羊MP抗體陽性檢出率19.66%的研究結果相似。不同年齡階段的綿羊對綿羊支原體肺炎的感染率不同，也說明防治綿羊支原體肺炎在羔羊時期應早發現早治療。

張道永等[18]（1998）在羊霉形體的研究中提到，不同品種的羊對綿羊支原體肺炎的易感性差異較大，進口種羊比本地羊易感。馬玉等[18]對新疆沙灣縣鄉鎮綿羊養殖場進行了血清MO抗體水平檢測，得出湖羊抗體陽性率（85.71%）遠高于阿勒泰羊（48.15%）和小尾寒羊（57.14%）。Chen C等采用間接血凝測定法分析了中國新疆六個地區四個不同品種羊（哈薩克羊、湖羊、美利奴羊和多浪羊）1 679份血清等樣本，結果表明四個品種綿羊的抗體陽性率在9.76%和30.61%之間，湖羊明顯高于其他品種。本次試驗中，伊犁地區MP-Ab平均陽性率16.62%高于巴州地區MP-Ab平均陽性率14.65%，但差異不顯著（P＞0.05)；綿羊品種間MP-Ab檢出的陽性率存在顯著性差異，分別在南北疆選擇的兩個試驗點的不同品種間MP-Ab檢出的陽性率均呈現顯著性差異。哈薩克羊與巴音布魯克羊為新疆本地綿羊品種，杜泊羊與薩福克羊為外來引進品種。在本地品種MP-Ab檢出的陽性率均顯著高于相同羊場飼養的外來引進品種，即哈薩克羊23.22%vs薩福克8.3%（P＜0.01）、巴音布魯克羊18.65%vs杜泊羊11.08%(P＜0.05)(表2)。盡管感染支原體量的多少、感染時間的長短、所處病理時期等因素均可能影響MP-Ab水平，對MP-Ab檢出結果產生一定偏差，但是目前的初步結果提示，不同綿羊品種對該病感染的應答存在一定差異。本地羊適應新疆的自然環境和氣候，并始終堅持自繁自養，雖然MP抗體、抗原陽性檢出率高，但感染該病后死亡率不高。在實地調查過程中，我們也觀察到本地品種羊只中表現咳嗽等發病癥狀的情況低于引進綿羊品種。提示，新疆引入綿羊品種與本地品種均可感染該病，但是該病在不同品種綿羊發病率可能存在差異。相關研究有待進一步展開。

伊犁地區薩福克羊MP-Ag陽性率20.61%，與哈薩克羊MP-Ag陽性率20.04%相似。在巴州地區，巴音布魯克羊MP-Ag陽性率17.91%高于杜泊羊MP-Ag陽性率11.08%與薩福克羊MP-Ag陽性率14.70%，但差異不顯著（P＞0.05）。這可能因為杜泊羊與薩福克羊在0～3月齡的羔羊感染了綿羊支原體肺炎，發病后致死率高于新疆本地綿羊，也有可能通過屠宰等方式淘汰患病羊，造成群體中感染該病的患病羊只數量減少，導致各試驗群體中MP-Ag檢出陽性率并未呈現沒有顯著性差異。本次試驗中，我們對引進到伊犁地區和巴州地區的薩福克羊MP抗原抗體檢出率進行比較，伊犁地區薩福克羊MP-Ag陽性率20.61%高于巴州地區薩福克羊14.70%，差異不顯著（P＞0.05），伊犁地區薩福克羊MP-Ab陽性率8.30%低于巴州地區薩福克羊13.23%，差異不顯著（P＞0.05）。說明，在新疆南北疆不同地區規模化羊場的養殖環境下，引進品種均可感染綿羊支原體。

通過對新疆地區不同綿羊品種綿羊支原體肺炎血清學調查，了解了伊犁地區與巴州地區綿羊支原體肺炎的感染情況，證實了其綿羊感染支原體肺炎十分普遍，初步掌握了南北疆該病在當地品種和引進品種綿羊感染情況。研究表明，定期對規模化養殖場羊群、山區牧民羊群以及鄉村農戶羊群進行綿羊支原體肺炎的排查，為兩地區綿羊支原體肺炎的科學防控提供血清流行病學依據，減少新疆養羊業的經濟損失。