早期帕金森病患者腦脊液生物標志物及炎癥因子水平的研究

楊凌飛 劉愛華 耿一萌 項 志 滕軍放△

鄭州大學第一附屬醫院 1)神經內科 2)腫瘤科，河南 鄭州 450052

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床中常見的神經系統退行性疾病，呈進展性病程。流行病學研究顯示，帕金森病患者的平均發病年齡約為60歲，男性略多于女性[1]，臨床表現包括運動及非運動癥狀[2-3]。運動癥狀主要表現為運動遲緩、強直、震顫和行走不穩，與黑質紋狀體系統多巴胺能神經元的變性缺失及α-突觸核蛋白異常沉積形成的路易小體有關[4-5]。目前，尚無特異敏感的生化指標可作為早期帕金森病臨床診斷的依據。該領域的研究主要集中在腦脊液神經元蛋白(α-syn、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)水平上，但結論尚未統一[6-9]。本研究旨在評估早期帕金森病患者腦脊液中生物標志物及炎癥因子水平及其相對比例在臨床早期階段的診斷價值。

1 資料與方法

1．1一般資料2016-09—2018-05收集鄭州大學第一附屬醫院神經內科門診及住院早期PD患者及健康對照者，52例早期帕金森病患者(Hoehn-Yahr 1～2.5級為早期)，35例健康對照組，共87例自愿參與本研究，均由兩位神經內科運動障礙方面專家共同診治，符合國際帕金森病和運動障礙協會(MDS)2015年帕金森病的臨床診斷標準[10]。2組納入標準：(1)愿意配合進行UPDRS評分、H-Y分級等測試，接受腰穿腦脊液檢查者，并簽署知情同意書；(2)可使用普通話溝通交流；(3)年齡50～80歲。健康對照組需滿足沒有任何神經及精神系統疾病。2組排除標準：(1)患有腫瘤和其他軀體嚴重疾病者，無法完成UPDRS評分等測試、腰穿腦脊液檢查；(2)3個月內服用左旋多巴及其他可能影響認知功能藥物者；(3)既往有腦炎、腦血管病、服用抗凝或抗精神病藥、重金屬中毒、腦積水等病史。本研究獲得了所有受試者的知情同意。

1．2方法

1．2．1 調查方法：①一般信息調查：收集姓名、性別、年齡等一般信息資料。②PD疾病情況調查：收集PD受試者病程、運動及非運動癥狀及左旋多巴的服用情況，進行帕金森綜合評分量表(unified parkinson’s disease rating scale，UPDRS) I-IV評分，評估運動障礙、日常生活行為、運動體征及運動并發癥情況，結合改良Hoehn-Yahr分級量表(H-Y分級)、簡易智能狀態檢查量表(Mini mental state examination，MMSE)、蒙特利爾認知評估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)輔助醫生進行臨床診斷。

1．2．2 腦脊液檢查：收取患者腦脊液樣品，取2～3 mL腦脊液用于炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)檢測，另取8～10 mL腦脊液收集在聚丙烯管中，并在提取10 min內以2 000 g離心10 min，隨后將上清液儲存于-80℃。采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定腦脊液中T-Tau、P-Tau和α-syn蛋白含量，通過單純分析蛋白濃度獲得各蛋白比例，使用T-Tau、α-syn蛋白作為分母來計算組合比率。1周后，囑受試者于相同時間段接受腦脊液炎癥因子檢測，取2次炎癥因子的平均值進行統計分析。

1．3統計學方法采用統計軟件SPSS 21.0進行數據分析。對所有樣本變量采用雙樣本t檢驗。使用接受者操作特征曲線(ROC)分析確定診斷準確性，并運用曲線下面積(AUC)量化評估診斷的總體水平(AUC越接近1，總體診斷性能越好)[11]，P<0.05為差異有統計學意義，檢驗水平α=0.05，并選擇雙側檢驗。

2 結果

2．1PD受試組及健康對照組一般情況52例早期帕金森病受試患者中，因無法配合腰椎穿刺術排除4例(女，63、64、71歲；男，78歲)，因無法配合臨床檢查或量表評分排除1例(女，69歲)，其余47例早期帕金森病患者滿足納入標準。早期PD受試者UPDRS評分、MMSE評分顯著高于健康對照者(P<0.001)，PD受試者UPDRS評分、H-Y評分、MMSE評分、MoCA評分情況見表1。

2．2腦脊液生物標志物及炎癥因子水平比較比較PD組與對照組腦脊液生物標志物水平，PD組腦脊液中α-syn蛋白水平低于對照組(P=0.007)，PD患者腦脊液CRP、IL-8、總體Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白水平較對照組有所升高，其中CRP(P=0.009)、IL-8水平差異有統計學意義(P<0.001)。以腦脊液中總體Tau蛋白濃度、α-syn蛋白濃度作為分母，以腦脊液中總體Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白作為分子，對比PD組與對照組后發現，PD組腦脊液T-Tau/α-syn及P-Tau/α-syn比例較對照組顯著升高(P<0.001)，PD組腦脊液P-Tau/T-Tau比例較對照組未出現顯著性差異。見表2。

表1 2組一般情況比較

2．3腦脊液臨床診斷價值運用ROC分析比較PD組與對照組生物學標志物的敏感性及特異性，腦脊液CRP水平具有較低的診斷價值(AUC=0.619；敏感性=58.8%；特異性=63.4%)，而α-syn(AUC=0.804；敏感性=77.2%；特異性=72.9%)、IL-8(AUC=0.848；敏感性=69.6%；特異性=90.4%)和P-Tau/α-syn比例(AUC=0.890；敏感性=86.8%；特異性=80.3%)具有較高的診斷價值。由于腦脊液IL-8水平在2次腦脊液檢測結果中變異性較大，選取CRP水平與P-Tau/α-syn比例組合作為鑒別診斷的指標，結果表現出更高的臨床診斷價值(AUC=0.931，敏感性=92.1%，特異性=78.0%)。見表3。

為評估帕金森病患者腦脊液生物標志物及炎癥因子與簡易智能狀態檢查量表(MMSE)評分的相關性，運用Pearson相關性分析對PD患者腦脊液α-syn，總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白、炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)及MMSE評分進行相關性分析，結果顯示，C反應蛋白、白介素IL-8、磷酸化Tau蛋白水平與MMSE評分間存在顯著相關性，其中，C反應蛋白水平與MMSE評分存在較強負相關性。見表4。

3 討論

本研究旨在評估帕金森病患者腦脊液生物標志物(α-突觸核蛋白、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)及炎癥因子(CRP、IL-8、TNF-α)水平及其相對比例在臨床早期的診斷價值。α-突觸核蛋白和Tau蛋白是腦內含量豐富的神經蛋白，既維持正常的突觸功能，又與神經退行性疾病密切相關，研究顯示，血漿Aβ、α-syn、T-Tau、P-Tau蛋白濃度變化與帕金森病的發病機制及運動障礙密切相關[12-13]。另有臨床研究表明，炎癥因子(CRP、IL-8、TNF-α)參與的免疫源性氧化應激是導致黑質紋狀體途徑神經元變性的原因之一[14-15]，其在血漿、腦脊液的改變趨勢得到廣泛研究，但由于疾病嚴重程度、個體變異性、樣品處理方法、分析方法的差異，結果存在較大分歧[16-18]。

據相關研究報道，PD患者腦脊液α-突觸核蛋白水平較正常者具有一定程度上的降低[19-20]，但將其作為鑒別早期PD患者的診斷依據尚不具有說服力[19]。關于PD患者腦脊液α-突觸核蛋白減少的機制有以下幾種觀點：α-突觸核蛋白主要在神經元內沉積，而不是積聚在細胞外空間中；α-突觸核蛋白的沉積導致神經元分泌功能活性降低；由于α-突觸核蛋白的播散導致正常神經元中編碼α-突觸核蛋白的基因(SNCA)表達量減少，并使α-突觸核蛋白胞吐作用的下降[21]。本研究驗證了臨床早期PD患者腦脊液α-突觸核蛋白水平較正常者顯著降低，為其用于輔助診斷臨床早期PD患者提供了新的支持。

表2 2組腦脊液生物標志物及炎癥因子值比較

注：TNF-α、CRP、IL-8值為2次腦脊液檢測的平均值，*P<0.05

表3 腦脊液生物標志物及炎癥因子在臨床診斷和鑒別診斷中的價值評估

注：*表示P-Tau /α-syn蛋白比例與CRP水平組合

表4 帕金森病患者腦脊液生物標志物及炎癥因子與簡易智能狀態檢查量表(MMSE)評分的相關性

注：N為樣本量，Pearson correlations為相關系數，*為相關性具有統計學差異

同時，PD患者腦脊液中Tau蛋白同種型(磷酸化的Tau蛋白)與α-突觸核蛋白兩者比例與對照組比較發現，PD患者腦脊液T-Tau/α-syn及P-Tau /α-syn蛋白比例顯著升高。一方面，Tau蛋白是神經系統中含量最高的微管相關蛋白，其在調節神經細胞生長發育過程中起關鍵作用，并參與神經元軸突通訊傳導過程。在神經退行性疾病(如阿爾茨海默病)中，過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經纖維纏結參與氧化自由基系統的啟動，后者可導致神經細胞的死亡。另一方面，Lewy小體作為PD患者重要的病理改變，其主要由α-突觸核蛋白組成，但同時含有少量Tau蛋白，因此，相關研究顯示，Tau蛋白的異構與α-突觸核蛋白的異常沉積連鎖導致帕金森病的病程進展[22]。這一理論也得到Tau蛋白病如進行性核上性麻痹(PSP)、皮質基底節變性(CBD)和突觸核蛋白病如PD的病理征重疊的支持[23-25]。本研究通過分析樣本數據得出，臨床早期PD患者腦脊液中總體Tau蛋白水平與對照組無明顯差異，而磷酸化Tau蛋白水平較對照組升高，這提示臨床早期PD患者中總體Tau蛋白水平未出現明顯改變，但Tau蛋白的功能性及結構性已經被破壞。

最新Meta分析顯示，炎癥因子在PD與健康對照組之間存在顯著差異[9]，提示PD的發病機制可能伴隨機體炎癥反應的失調。本文證實早期PD患者腦脊液C反應蛋白及IL-8水平顯著升高，但IL-8水平在2次腦脊液檢測中變異性較大，提示腦脊液C反應蛋白值有成為炎癥生物標志物的潛能。將相對穩定的C反應蛋白值與PD相關生物標志物(α-突觸核蛋白、Tau蛋白)水平結合，可進一步增加對診斷臨床早期PD患者的診斷價值。

本研究發現，帕金森病患者腦脊液中生物標志物及炎癥因子水平與認知障礙程度相關，并通過Pearson相關分析帕金森病患者腦脊液中炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)及α-syn，總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白水平與MMSE評分的相關性證實了該觀點，但是否與帕金森病的發病機制相關尚待進一步研究。有研究表明，C反應蛋白是肝臟合成的一種炎癥誘導物質，其對內皮細胞、內皮母細胞、白細胞和血小板都發揮強大的促炎作用，并可能放大炎癥反應[26-30]。在長期隊列研究中，帕金森病患者血清炎癥因子水平，如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10水平的升高與認知障礙程度MMSE評分的降低之間存在顯著相關性，以此反映外周免疫反應的促炎/抗炎因子平衡破壞與帕金森病認知障礙程度存在關聯性[31-33]，但一直缺乏中樞神經系統促炎/抗炎因子平衡紊亂的直接證據，本文通過研究C-反應蛋白等炎癥因子與帕金森病認知障礙程度的相關性分析，為中樞神經系統促炎/抗炎因子平衡紊亂及其與認知障礙程度的關聯提供數據支持，對臨床預測帕金森病患者認知障礙預后程度提供了新的思路。

本研究通過ELISA檢測對相關蛋白進行定量檢測，結果顯示早期帕金森病患者腦脊液α-syn蛋白水平顯著降低，CRP、IL-8水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例顯著升高，提示腦脊液α-syn，CRP水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例可能具有帕金森病生物標志物的潛能，其中C反應蛋白與磷酸化的Tau蛋白/α-突觸核蛋白比例組合可更準確的協助臨床早期診斷，提示。此外，早期PD患者腦脊液總體Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白濃度呈現小幅度升高，尚無統計學差異，但隨著更大規模的臨床研究開展，其變化趨勢及應用潛能可獲得進一步探討。