七氟烷對新生大鼠海馬caspase-3和磷酸化ERK表達的影響

呂淼淼 楊現會

鄭州大學第二附屬醫院麻醉科，河南 鄭州 450003

七氟烷因其起效迅速，蘇醒快，作用時間短，為小兒臨床麻醉常用藥。動物實驗表明，七氟烷可引起發育期大腦神經細胞凋亡，影響認知功能發育[1-4]。臨床上也有七氟烷致小兒神經功能異常的報道[5]。研究表明，在神經細胞凋亡的早期，caspase信號通路被激活[6-7]。磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)作為一種抗凋亡蛋白，可通過調節眾多基因轉錄的表達促進抗凋亡信號傳導，發揮神經保護作用。本研究擬評價p-ERK在七氟烷致新生大鼠海馬神經細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1．1實驗動物分組出生7 d的健康清潔級雄性SD大鼠36只，體質量11～18 g，購自鄭州大學實驗動物中心。采用隨機數字表法分為2組(n=18)：對照組(C組)每天同一時間吸入30%氧氣2 h/次；七氟烷組(S組)吸入3.4%七氟烷+30%氧氣2 h。將S組大鼠置于密閉麻醉箱中，箱底鋪鈉石灰，箱兩側各有一小圓孔，一側為排氣孔，并接 S/5型麻醉氣體監測儀(Ohmeda Detax，美國)，監測氧氣，七氟烷和二氧化碳濃度；另一側為進氣孔，接七氟烷麻醉揮發罐，輸入3.4%七氟烷(雅培制藥有限公司，美國)和30%氧氣，S組吸入3.4%七氟烷2 h，氧流量為3 L/min，麻醉過程中塑料箱下墊加溫毯，溫度探頭插入大鼠直腸，維持肛溫37 ℃，維持大鼠自主呼吸，同時翻正反射消失。對照組只吸入30%氧氣2h，流量為3 L/min。

1．2方法

1．2．1P(O2)、P(CO2)與血糖濃度檢測：于麻醉結束后15 min，每組隨機取2只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后立即開胸，于左心室心尖部取血100 μL，檢測動脈血P(O2)、P(CO2)與血糖濃度。

1．2．2 激活型caspase-3和p-ERK檢測：于麻醉結束后15 min(T1)和麻醉結束后6 h、24 h和48 h(T2-4)，每組各隨機取4只大鼠，麻醉處理后斷頭并立即冰上取新鮮海馬組織，液氮速凍，然后-80 ℃冰箱保存，采用Western blotting法檢測活化caspase-3和p-ERK的表達。取凍存的海馬組織，勻漿，裂解后提取蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。蛋白與5x上樣緩沖液混合后，37 ℃變性30 min，采用10%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE電泳，轉膜，激活型caspase-3抗體(1：1 000)、β-actin抗體(1：2 000，Santa Cruz公司，美國)、磷酸化ERK抗體(1：1 000，CST公司，美國)和ERK抗體(1：1 000)，4 ℃孵育過夜，1：2 000二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。采用ECL(Amersham公司)化學發光檢測試劑盒膠片顯影。

2 結果

2．1新生大鼠生理指標和血氣分析檢測2組大鼠在實驗過程中呼吸均勻，皮膚顏色未見明顯變化，未見呼吸加深加快、呼吸暫停、呼吸停止等發生。2組pH值和血糖濃度均在正常范圍。見表1、圖1。

2．2新生大鼠海馬激活型caspase-3和磷酸化ERK表達的變化與C組比較，S組T1和T2時海馬活化caspase-3的表達上調(P<0.05)，T1和T2時海馬p-ERK的表達下調(P<0.05)。見表2。

3 討論

新生兒期的大腦發育迅速，神經元增殖、分化等異常活躍，同時也是中樞神經系統的易感期，對內外環境變化非常敏感。研究表明[8-11]，新生小鼠長時間吸入氟烷，可導致其神經細胞大量凋亡，成年后小鼠神經行為學檢測也表現為異常。新生大鼠海馬的快速發育期為出生后7 d[12-15]，故本實驗以此為研究對象。

所有吸入七氟烷的新生大鼠均在監護儀監測下進行，目的是排除呼吸和循環抑制對實驗結果的影響，確保七氟烷是本實驗的唯一變量指標。

Caspase又稱半胱氨酸蛋白酶，其家族在細胞凋亡過程中起主要作用，分為不同的類型，但最終都需要激活caspase-3完成凋亡，在細胞凋亡中起著不可替代的作用[8，16-30]。本研究顯示，新生大鼠吸入七氟烷后，海馬區caspase-3被大量活化，神經細胞凋亡增多，提示七氟烷可能通過活化caspase-3誘發了新生大鼠神經細胞凋亡。動物實驗顯示[31-40]，應用caspase-3抑制劑可明顯減輕神經細胞損傷與脊髓損傷，觀點支持本實驗結果。

細胞外信號調節激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導家族成員之一。一般認為，進細胞增殖、分化與ERK信號通路密切相關。其中Ras-Raf-ERK通路是目前研究較清楚的一條信號通路[41-46]。激活的ERK參與體內諸多的生理過程，其中在神經元細胞的增殖、分化和抑制凋亡中起重要作用[47-51]。吸入七氟烷后p-ERK表達下調，凋亡神經細胞增多，提示七氟烷可能通過下調p-ERK的表達，導致新生大鼠海馬神經元凋亡。因此，七氟烷致新生大鼠海馬神經細胞凋亡的機制可能與下調p-ERK表達有關。

表1 2組大鼠P(O2)、P(CO2)和血糖濃度比較

圖1 2組P(O2)、P(CO2)和血糖濃度情況Figure 1 P(O2), P(CO2) and blood glucose concentration in two groups

指標組別T1T2T3T4活化caspase3C組0.11±0.020.13±0.010.13±0.030.10±0.04S組0.43±0.05?0.87±0.13?2.36±0.17???1.12±0.08??pERKC組0.36±0.210.68±0.321.16±0.361.32±0.41S組0.21±0.01?0.56±0.191.25±0.231.38±0.31

注：與C組比較，*P<0.05