內蒙勝利褐煤生物產氣前后微生物群落變化

趙 晗，何 環，王江澤，譚凱麗，趙 娜，任恒星

(1.山西晉城無煙煤礦業集團有限責任公司 煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000; 2.中國礦業大學 化工學院,江蘇 徐州 221116; 3.中國礦業大學 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221116; 4.易安藍焰煤與煤層氣共采技術有限責任公司，山西 晉城 048000)

煤的生物產氣是由產甲烷相關功能菌厭氧代謝煤或煤層物質產生的以甲烷為主要成分的氣體[1-2]。已有研究表明，褐煤中含有較多有機物質，所以容易被本源和外源微生物降解形成生物氣[3-4]。我國擁有豐富的褐煤資源，主要分布在內蒙和云南等地，其中內蒙褐煤約占我國褐煤資源的70%，因此對內蒙褐煤資源開展生物產氣研究對拓寬煤炭清潔利用途徑具有重要意義。

目前國內外學者對煤生物產氣環境中微生物群落結構研究表明，不同來源樣品中微生物群落組成差異較大[5-6]。HE等[7]發現山東趙樓一處不產煤層氣煤層水樣品中細菌種類豐富而產甲烷古菌豐度較低。而DARIUSZ等[8]研究發現產甲烷菌Methanocorpusculum是伊利諾斯盆地環境中的主要菌屬。也有研究人員報道日本近海的海底煤層中存在一類能夠直接利用煤中苯甲氧基化合物形成甲烷的古菌Methermicoccus[9-10]。

研究過程中也發現同一個取樣點的煤層和煤層水中微生物群落也存在較大差異[11]。DONALD等[12]研究發現粉河盆地煤層中的產甲烷菌主要有Methanobacterium等古菌，而地下水中主要為Methanocaldococcus等古菌。GUO等[13]發現鄂爾多斯盆地中煤層水、煤和巖石表面微生物分布存在差異，其中煤和巖石表面的細菌組成較接近，但是和煤層水中細菌組成差異卻很大，古菌Methanolobus在水、煤和巖石表面分布均較多，而Methanobacterium卻僅在煤中有分布。VICK等[14]報道產氣初期Desulfuromonas，Campylobacter，Sulfurospirillum和Streptobacillus是吸附到煤表面的微生物，而游離體系中豐度最高的微生物卻是產甲烷古菌。可見，不同來源的環境樣品以及同一樣品不同時間和空間的微生物群落組成均存在差異。

也有研究人員報道不同來源富集到的外源環境微生物樣品也可以利用其他礦區開采煤進行生物產氣[6-7]。晉城是我國重要的無煙煤產區，前期研究表明該地區寺河礦煤層氣抽采排出水中微生物富集樣品可以利用無煙煤進行生物產氣[15]，但是否也可以利用褐煤產氣卻不清楚。筆者利用寺河礦區煤層氣抽采井排出水富集菌群作為產氣微生物，內蒙勝利褐煤作為產氣底物，在實驗室進行褐煤微生物產氣模擬實驗，采用高通量測序方法分析了產氣前后微生物菌群組成變化情況，并對產氣前后煤的物化性質進行了分析。

1 材料與方法

1.1 褐煤樣品采集及理化性質分析

煤樣取自內蒙古神華北電勝利露天煤礦褐煤5號煤層，試驗時將煤樣破碎篩分至1～2 mm顆粒進行生物產氣模擬試驗。其中煤工業分析和元素分析按照國家標準GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進行。

1.2 產氣菌群富集培養和生物產氣實驗

實驗采用寺河礦區煤層氣井產出水，采集水樣后置于厭氧發酵罐內添加培養基和寺河礦開采新鮮無煙煤煤塊進行富集培養，培養基制備方法同文獻[15]。定期放出部分菌液，補充等量新鮮培養基，減少有害代謝產物對菌群產氣能力的影響，待產氣能力穩定后作為菌液待用。

選用500 mL厭氧瓶進行褐煤產氣實驗，設置試驗組和對照組，每組3個平行，實驗數據為平均值。對照組加入250 mL培養基和50 mL菌液;試驗組，加入等量培養基、菌液和10 g煤樣。實驗時，在厭氧工作站(英國，DWS DG1000)中按設置分裝好培養基、菌液和煤樣，密封保證厭氧環境，35 ℃恒溫培養。每7 d檢測氣體組分，并記錄產氣量，同時在實驗初期、末期分別取樣進行高通量測序，分析微生物群落結構。

產氣過程中氣體組分采用美國Angilent 7890 氣相色譜儀分析，配Carbonplot色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和 TCD 檢測器，氣密針進樣，進樣量0.5 mL。色譜進樣口溫度150 ℃，柱溫箱溫度30 ℃，檢測器溫度200 ℃[15]。甲烷體積分數=甲烷實際出峰面積×甲烷標氣中甲烷體積分數/標氣中甲烷平均峰面積。為準確研究煤樣產甲烷率，通過去除對照組產甲烷量計算凈產甲烷率。凈產甲烷率計算公式為

Q=(qncn-q0c0)/m

式中，qn為試驗組產氣量，mL;cn為試驗組產甲烷體積分數，%;q0為對照組產氣量，mL;c0為對照組產甲烷體積分數，%;m為實驗所用煤量，g。

1.3 褐煤產氣前后菌群結構和煤物化性質分析

取10 mL培養液(包含煤粉)樣品10 000 rpm離心收集沉淀，采用試劑盒(EZNA water DNA kit，OMEGA)提取沉淀樣品中基因組DNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組的完整性，利用 Qubit2.0 DNA 試劑盒檢測基因組 DNA 濃度。利用特異性引物PCR擴增V3-V4可變區。PCR產物進行瓊脂糖電泳，采用DNA膠回收試劑盒(RTP2201，中科瑞泰)對 PCR產物進行回收。回收的PCR產物通過Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量，并添加測序標簽，采用賽哲生物的 Illumina測序平臺完成對樣品高通量測序。測序結果采用分析軟件將序列按照序列相似性為97%的閾值進行OTUs(operational taxonomic units)操作分類單元聚類，此外對樣品序列進行Alpha多樣性統計分析，包括ACE，Chao1，OTUs和Shannon等。其中Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻性的綜合指標，群落豐富度的指數主要包括Chao1指數和ACE指數，群落多樣性的指數主要包括Shannon指數和Simpson指數。

褐煤生物產氣實驗后，用無菌超純水浸泡洗滌3次，室溫下充分干燥后，對殘煤進行工業分析和元素分析。另取部分產氣前后煤樣品用于電鏡(ZEISS EVO MA15)觀察，原煤干燥后直接用離子濺射儀噴金(ETD-2000C)觀察，殘煤先使用2.5%(V/W)戊二醛在pH 7.2的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液固定2.5 h，然后對樣品進行乙醇逐級脫水[16]并在空氣干燥24～48 h后，噴金觀察煤表面微生物形貌特征。

圖1 褐煤產甲烷變化曲線Fig.1 Methane product curves of lignite

2 結果與討論

2.1 勝利褐煤生物產氣

褐煤生物產氣試驗結果如圖1所示，對照組在0～7 d有短暫的延滯期，接種微生物利用培養基進行大量繁殖，7～14 d開始有甲烷產生，體積分數緩慢上升，在14 d達到峰值4%，利用完可用有機物后，產氣停滯甲烷體積分數保持不變，累計產甲烷量為4.7 mL。相比之下試驗組因反應體系中加有煤樣，可利用底物豐富，微生物快速繁殖代謝，0～7 d甲烷體積分數達4.5%，7～14 d甲烷體積分數速增至25%，隨后產氣開始緩慢穩定的持續升高，峰值達41%，42 d后甲烷體積分數降低，產氣周期結束。整個實驗周期內累計產甲烷量為83.1 mL，凈產甲烷率為7.84 mL/g。

有報道稱褐煤利用外源產甲烷菌群的產氣周期為28 d，可以分為產氣速率顯著增高、緩慢增高、趨于停止3個階段[7]，這與本研究中外源產甲烷菌群產氣規律不同。原因可能有兩方面:① 上述文獻中所用煤樣與本文不同，不同煤樣具有不同的理化性質，可被微生物利用降解的程度也不相同;② 雖然同為產甲烷菌群，但菌群結構差異較大，文獻所用菌源為馴化沼液，而本文為煤層水微生物富集培養得到。

2.2 褐煤生物產氣前后微生物群落結構分析

表1為實驗所用微生物在培養前后的Alpha多樣性統計結果。其中寺河煤層水富集微生物樣本中共觀察到964個OTU，而經過產氣培養后的對照組和試驗組分別下降為368和436個OTU，結合Shannon值等多樣性指數可以看出群落多樣性由高到低分別為:原始>試驗組>對照組，原始微生物群落結構多樣性較高，經生物產氣后，對照組與試驗組群落結構發生較大變化。其中對照組只添加了少量培養基，營養單一，試驗組添加了褐煤煤粉，雖然底物較對照組豐富，但兩者微生物多樣性均有降低，推測可能是由于寺河礦區為無煙煤，富集時采用煤也為無煙煤，所以得到菌群對無煙煤有更好的適應性，而采用褐煤做底物或者是基本培養基培養時，微生物菌群適應性降低，所以菌群多樣性下降。

表1 樣品間Alpha多樣性統計Table 1 Alpha diversity of bacterial communities at different fermentation stages

圖2和3分別為原始和試驗及對照組產氣后菌群在門和屬水平的群落組成分析。由圖2可知褐煤生物產氣所用原始微生物中主要優勢菌門包括厚壁菌門(Firmicutes，27%)、WWE1(25%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，21%)、互養菌門(Synergistetes，13%)以及豐度較低的變形菌門(Proteobacteria，5%)和綠彎菌門(Chloroflexi，1%)。經過一段時間的培養后微生物門類結構發生明顯變化，其中試驗組微生物中主要優勢菌門主要為厚壁菌門(Firmicutes，40%)、變形菌門(Proteobacteria，19%)、WWE1(13%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，8%)、互養菌門(Synergistetes，6%)和少量的脫鐵桿菌門(Deferribacteres，2%);而對照組中微生物優勢門類則減少為3類，依次為厚壁菌門(Firmicutes，73%)、變形菌門(Proteobacteria，22%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，3%)。從屬水平上群落豐度分析可以發現，在原始微生物中W22(38%)是該富集樣本中豐度最高的微生物，其次為Proteiniclasticum(21%)和VadinCA02(18%)。經褐煤生物產氣培養后的試驗組中W22(22%)依然保持優勢地位，脫硫弧菌屬Desulfovibrio(22%)也占有相同比重，其次為Tissierella_Soehngenia(11%)和VadinCA02(10%)(b)。可見，褐煤富集會對原始菌群的組成產生影響，原始菌群中的Proteiniclasticum相對豐度急劇減少，而脫硫弧菌屬Desulfovibrio和Tissierella_Soehngenia在原始菌群中可能豐度較低均沒有檢測到，但是產氣后其豐度明顯上升。對照組中豐度最高的微生物則為厚壁菌門中的Tissierella_Soehngenia(58%)，其次為Clostridium(16%)(c)。

圖2 原始微生物、試驗組、對照組在門水平多樣性分析Fig.2 Biodiversity analysis of original microorganism, experimental group and control group at phyla level

厚壁菌門在3組樣品中占比最大，其中的微生物主要參與一些混合酸、醇和中性物質的生成。其中的Proteiniclasticum和梭菌屬(Clostridium)均屬于梭菌科參與一些纖維質、幾丁質等水解過程[17]。Tissierella菌屬可以利用有機物代謝產生乙酸、丁酸、氨氮、CO2等物質[18]。互養單胞菌(Syntrophomonas)、醋桿菌屬(Anaerovorax)等在降解多糖、脂肪酸等有機物、產氫產酸等過程中扮演重要角色[19-21]。未培養WWE1菌門在產甲烷混合菌群中常被檢測到，在降解烴類和纖維素等物質過程中發揮重要作用[22-23]，可能具有將丙酸氧化為乙酸和 CO2的能力[24]。WWE1菌門中的W22其具體功能還未見文獻報道，有待進一步研究。擬桿菌門是一類化能自養型微生物，樣品中屬于該門的微生物主要有產電菌(Dysgonomonas)和產酸菌(Paludibacter)，它們可能參與苯酚等有機物的降解產酸等過程，在微生物燃料電池等反應器中也有發現報道[25-26]。變形菌門物種豐富，具有極為廣泛的代謝類型，其中脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)為硫酸鹽還原菌，可將硫酸鹽還原為H2S，為微生物提供能量，減輕對甲烷菌的競爭性抑制和毒害作用[27]。檢測到的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)具有降解長鏈烷烴、還原硫酸鹽等功能[28-29]，互營菌屬(Syntrophus)常在降解石油烴等富集物中被檢測到，具有降解烷烴、長鏈脂肪酸等功能[30-31]。地桿菌(Geobacter)是隸屬變形桿菌δ亞綱的Fe(Ⅲ)還原細菌，廣泛分布于厭氧沉積環境中，具有代謝乙酸鹽的特征[32]。樣品中屬于互養菌門中的微生物分別有胺小桿菌屬(Aminobacterium)、產氫產乙酸菌屬(Sedimentibacter)，它們是厭氧系統中重要的氨基酸降解和產氫產乙酸的功能細菌，該類微生物在連接水解發酵過程與產甲烷過程中起重要作用[33-34]。脫鐵桿菌門是一類通過專性或兼性厭氧代謝獲得能量的細菌，可利用多種電子受體，在試驗組中檢測到較低豐度的菌群[35]。VadinCA02和VadinHB04在原始和試驗組樣品中豐度較高，有研究表明在廢水處理器中常被檢測到，在有機物降解過程中發揮重要作用[36-37]。

圖3 原始微生物、試驗組、對照組在屬水平多樣性分析Fig.3 Biodiversity analysis of original microorganism, experimental group and control group at genus level

原始微生物中古菌主要為廣古菌門(Euryarchaeota)中的甲烷囊菌屬Methanoculleus(1%)，而培養后的試驗組中古菌主要為瘤胃古菌中的VadinCA11(1%)。Methanoculleus屬于甲烷微菌球綱，該綱是目前產甲烷古菌研究報道最多的微生物，可以利用 H2/CO2、甲酸鹽等小分子產生甲烷[38-39]。

2.3 褐煤生物產氣前后煤理化特性和表面微生物形貌分析

勝利褐煤基本理化性質分析見表2，煤樣揮發分較高為33.96%，具有富氫、富氧等基本特征。對比試驗前后煤樣理化特性可知，經微生物降解作用后，水分、灰分揮發份均降低，固定碳百分比升高，在脫硫菌、產氫產乙酸菌等的作用下，煤樣H/C升高，S,O元素比例下降，說明煤中易被微生物利用的短鏈和側鏈被降解，剩下復雜的高分子結構難以降解。

表2 褐煤工業分析和元素分析結果Table 2 Lignite industry analysis and elemental analysis results

原煤樣品的掃描電鏡結果(圖4(a))表明煤表面結構松散，有明顯的裂隙，有的裂隙大于10 μm有利于微生物附著降解，適宜進行生物產氣模擬試驗。生物產氣試驗后，觀察煤樣表面(圖4(b))出現大量不同細胞形態的微生物結構，其中最豐富的是形態為1.0～1.5 μm短桿狀和球狀細胞，部分稍彎曲，主要位于煤表面較平整的區域。因厚壁菌可以產生芽孢，可以抵抗脫水和極端環境，結合測序結果分析可能是厚壁菌門的Tissierella_Soehngenia,Clostridium和Desulfovibrio等。同時還有一些形態較為特別的類型，比如直徑約0.2 μm，長度為15 μm甚至更長更細的桿狀結構，形態為3～5 μm的鏈球狀結構等等，這些絲狀結構的微生物有可能與微生物之間形成的納米導線相關，其具體形成及其作用還有待進一步研究[40]。

圖4 褐煤原煤樣品和生物產氣后樣SEM照片Fig.4 SEM images of lignite and after biogas production

3 結 論

(1)寺河礦區的煤層水富集微生物可以利用勝利褐煤進行產氣，其產氣周期為49 d，期間累計產甲烷量為83.1 mL，凈產甲烷率為7.84 mL/g煤。

(2)測序結果表明，褐煤產氣微生物門類主要集中在厚壁菌門、WWE1、互養菌門、變形菌門、擬桿菌門和廣古菌門。原始微生物群落結構多樣性較高，經褐煤和基本培養基產氣后，群落多樣性降低。其中W22,Proteiniclasticum,VadinCA02,Tissierella_Soehngenia,Clostridium,Desulfovibrio等菌屬在褐煤產氣過程中發揮重要功能。

(3)褐煤在生物產氣作用后，水分、灰分、揮發分均降低，固定碳百分比升高，H/C升高，S元素比例下降，利用掃描電鏡觀察表面附著大量短桿狀和球狀細胞結構，并存在類似微生物納米導線結構。