EB 病毒轉(zhuǎn)化外周血B 淋巴細(xì)胞建永生細(xì)胞系的四種方法探討

木耶賽爾·伊斯馬依力 郭偉鵬 徐保紅 喬艷輝

（烏魯木齊市血液中心 血液研究室，新疆 烏魯木齊 830000）

本研究利用EB 病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別用環(huán)抱霉素A 轉(zhuǎn)化法、外周血淋巴細(xì)胞凍存轉(zhuǎn)化法、微量全血轉(zhuǎn)化法、微量全血凍存轉(zhuǎn)化法將部分RhD 陽性（D 變異型)獻(xiàn)血員外周血B 淋巴細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化成永生細(xì)胞系。

1 研究對象，材料,方法，儀器設(shè)備

1.1 研究對象

本研究在知情同意原則下，在烏魯木齊市血液中心無菌采集30 例RhD 陽性（變異型）無償獻(xiàn)血者血液樣本，采用肝素抗凝。采集的血液樣本，在運(yùn)輸過程中應(yīng)保持常溫，不要冷凍。采集的血液樣本的運(yùn)輸盡可能地快捷，一般應(yīng)在采集后24～48 小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。采集的血液樣本在運(yùn)輸中應(yīng)盡可能不要震蕩，以避免溶血。

1.2 材料

R PM I-1640 (Biosharp 北京),淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，環(huán)孢霉素A (Cyclosporine A，CyA )購自北京索菜寶科技有限公司、胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、三B95-8 狨猴EBV 轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞ZQ0164 購自上海中喬新丹生物科技有限公司、二甲基亞砜DMSO(德國Biofroxx)。

1.3 耗材

離心管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、移液管、濾器、濾膜、試劑瓶、二氧化碳、液氮等。

1.4 儀器設(shè)備

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、電熱干燥烘箱、程序降溫盒、- 80℃超低溫冰箱、電動移液器、水平式離心機(jī)、超純水儀、電子天平、恒溫水浴箱、普通冰箱、超低溫冰箱、液氮保存罐和轉(zhuǎn)運(yùn)罐。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

凍存液:90%的胎牛血清加10%的二甲基亞砜，混勻，經(jīng)0.2μm 抽濾，避光保存（在4℃或-200℃）。凍存細(xì)胞時(shí)，一般每一凍存管放1ml 為好(可控制復(fù)蘇時(shí)的時(shí)間)。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)在37℃水浴中解凍，整個(gè)過程時(shí)間約1 分鐘左右。待細(xì)胞融化后用無血清的RMPI-1640 液洗滌1 次，去上清，輕彈管底將細(xì)胞彈散，重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清培養(yǎng)基的（3ml）T-25 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布，放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。過夜后，觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量，及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基。以上方法都參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。

1.5.2 EBV 懸液的制備，CyA 工作液，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

EBV 懸液來自B-958 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，凍存管的B-958細(xì)胞快速復(fù)蘇，轉(zhuǎn)入含20%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液的T-25 培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)3-4 天加一次培養(yǎng)液。饑餓培養(yǎng)7-10 天后，收集上清液，反復(fù)凍融3次，2000r/min 離心10min,上清經(jīng)0.22um 膜過濾，分裝后-70℃保存?zhèn)溆谩yA 液:，環(huán)孢霉素A (Cyclosporine A ，CyA )購自北京索菜寶科技有限公司，用無血清培養(yǎng)基稀釋成0.2mg/ml，使用時(shí)最終濃度為2ug/ml。

1.5.3 外周血淋巴細(xì)胞的分離：取3-5ml 肝素抗凝血，加倍量的RPMI1640 液稀釋，小心加在37℃預(yù)熱的淋巴細(xì)胞分離液上, 3000r/min 離心30 min，小心移出界面層細(xì)胞，用RPMI1640液在1000 r/m in、10 min 條件下洗滌3 次，留下細(xì)胞沉淀。

1.5.4 四種轉(zhuǎn)化方法

微量全血轉(zhuǎn)化法：取抗凝全血0.1-0.5ml,置25ml 培養(yǎng)瓶中，加EBV 病毒1.8ml 及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液培養(yǎng)液2ml, 置37℃，5ml/L CO2培養(yǎng)箱。2-3 周后可在紅細(xì)胞層中觀察到淋巴細(xì)胞體積增大，形態(tài)似母細(xì)胞樣的細(xì)胞團(tuán)，此后每3-4 天半量換液，直到紅細(xì)胞及碎片基本換掉，6-7 周即可凍存。

凍存全血法：取抗凝全血0.5ml,加入1ml 細(xì)胞凍存液，混合后置低溫冰箱（-40℃），2 天之后移至液氮中。細(xì)胞凍存一周以上后分批在37℃水浴快速復(fù)蘇，轉(zhuǎn)入T-25 培養(yǎng)瓶中，8ml RPMI1640 培養(yǎng)基，3000r 離心洗滌2 分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀物加入新鮮EBV 上清1.8ml 和含20%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基3ml 吹打均勻，加入25cm3培養(yǎng)瓶在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。一般5-7 周后可凍存。

環(huán)孢霉素A(CyA)轉(zhuǎn)化法：在洗滌3 次后的淋巴細(xì)胞裝好3ml EB 病毒液及3ml RPMI1640 完全培養(yǎng)基的25cm3培養(yǎng)瓶中，再加入環(huán)孢菌素A (終濃度為2ug/ml )，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于5 天左右進(jìn)行鏡下觀察，根據(jù)培養(yǎng)液PH 值的改變半量進(jìn)行換液，約5-7 周可行細(xì)胞凍存。

凍存白細(xì)胞轉(zhuǎn)化法：按1.5.3 分離淋巴細(xì)胞液，加細(xì)胞凍存液1ml 混勻后置-70℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮中凍存，2 周后復(fù)蘇，轉(zhuǎn)入EBV 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入T-25 培養(yǎng)瓶中，8ml RPMI1640 培養(yǎng)基，3000r 離心洗滌2 分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀物加入新鮮EBV 上清1.8ml 和含20%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基3ml 吹打均勻，加入T-25 培養(yǎng)瓶在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。一般5-7 周后可凍存。

2 結(jié)果與討論

我們采用四種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞30 株，結(jié)果見表1 和圖1、圖2。

表1 四種EBV 轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞方法的結(jié)果

圖1 轉(zhuǎn)化EB 細(xì)胞一周后的結(jié)果（×200）

圖2 轉(zhuǎn)化EB 細(xì)胞四周后的結(jié)果（×400）

我們采用這四種方法對RhD 變異型無償獻(xiàn)血者血液樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中微量全血法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5 株，4 株轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成功，全血凍存法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5 株，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成功5 株，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成功4株，環(huán)孢霉素A(CyA)轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)15 株，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成功15 株，分離淋巴細(xì)胞凍存后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5 株，轉(zhuǎn)化成功5 株，總計(jì)28 株轉(zhuǎn)化為永生細(xì)胞系，一次建株成功率93.3%。

3 討論

運(yùn)用微量全血法，全血凍存法，環(huán)孢霉素A(CyA)轉(zhuǎn)化法，凍存白細(xì)胞法對全血進(jìn)行轉(zhuǎn)化，均可成功建系。微量全血法在轉(zhuǎn)化后2-3 周左右可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞，凍存全血法在轉(zhuǎn)化7-8 天左右可見到增大的淋巴細(xì)胞，35-40 天細(xì)胞成團(tuán)。按建系效率從高到低依次為:環(huán)孢霉素A 法、凍存白細(xì)胞法、凍存全血法和微量全血法。在血量充足的情況下,可選擇環(huán)孢霉素A 法進(jìn)行建系，得到較高的成功率，對于適合珍貴不可第二次獲得的樣本的處理。微量全血法和凍存全血法因具有操作簡單，所需標(biāo)本量少的優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛采用。

由于各種方法轉(zhuǎn)化效率各有不同，并且同一種方法對不同個(gè)體來源的淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。在本項(xiàng)目中我們將研究不同轉(zhuǎn)化方法對不同來源血液樣本轉(zhuǎn)化效率的區(qū)別和其中的規(guī)律，研究轉(zhuǎn)化過程中的影響因素，B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化速度取決于EB 病毒濃度。文獻(xiàn)報(bào)道[4]每瓶培養(yǎng)細(xì)胞加1.4mlEB 病毒，本實(shí)驗(yàn)剛開始加1.4mlEB 病毒，轉(zhuǎn)化速度慢，兩周都看不見轉(zhuǎn)化細(xì)胞，后面加入1.8ml,2mlEB 病毒，結(jié)果加入1.8mlEB 病毒時(shí)轉(zhuǎn)化速度最快。

由于外周血易于取材，外周血淋巴細(xì)胞就成為細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)常用的研究材料。但淋巴細(xì)胞離體后生存周期短且不能增殖傳代培養(yǎng)，常需反復(fù)抽取患者血樣，如患者去世具有特定生物學(xué)形狀的標(biāo)本也隨之丟失，這就對病人的長期深入研究帶來很大困難。近年發(fā)展起來的應(yīng)用EB 病毒轉(zhuǎn)化人外周血B 淋巴細(xì)胞使之永生化的技術(shù)[3]，使永久保存人類基因組和特定的疾病基因組資料成為可能。

EB 病毒是一種高效率的轉(zhuǎn)化病毒，它的靶細(xì)胞僅限于人類的B 淋巴細(xì)胞，對其它類型的細(xì)胞沒有感染的危險(xiǎn)性[4]。利用EB 病毒轉(zhuǎn)化人類外周血細(xì)胞使成為具有永生化特性的LCL 用保存人類全基因組完全可以的。本文進(jìn)一步證實(shí)，微量全血法和全血凍存法適合于短時(shí)間內(nèi)采集大樣本量采集、儲存然后逐步轉(zhuǎn)化的研究課題所選用。環(huán)孢霉素A(CyA)轉(zhuǎn)化法，凍存白細(xì)胞法則適合于珍貴而且不易獲得二次采樣的研究課題。