食品多酚與蛋白相互作用及其對多酚生物可利用性影響的研究進展

郄雪嬌，程亞，曾茂茂，高大明，秦昉，陳潔，何志勇

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

多酚是植物體內的次級代謝產物，是具有不同數量羥基芳香環化合物的統稱，廣泛存在于水果、蔬菜、茶、豆科類以及中草藥等植物內。目前多酚類化合物已超過10 000多種，是最大的一組植物化學物質[1]。多酚因具有強抗氧化、抗癌、控制肥胖、緩解抑郁、保護心臟、調節膽固醇水平以及控制高血壓和心腦血管疾病等生理功能而成為國內外醫藥、保健、功能食品研究領域的關注焦點[2-3]。但是食品多酚生理功效的發揮跟其生物利用率有密切關聯，會受到食品中其他組分、加工條件、胃腸道消化環境等多種因素的影響，因此，需要對多酚進行生物可利用性研究，以評估攝入后經過胃腸消化/吸收階段釋放的多酚物質能夠到達全身循環的量。目前諸多研究表明，食品中多酚類物質會與食品其他成分，如糖類、蛋白質、淀粉以及其他小分子物質發生反應，從而改變多酚在食品體系的存在狀態，最終導致其在機體內的生物可利用性發生變化，造成其生理功能的改變。蛋白是食品組分中具有重要生理功能的一大類物質，因此研究食品體系中多酚與蛋白質之間的相互作用及其對多酚生物可利用性的影響，對于提高食品多酚類物質的生物利用性和健康功能性，促進含多酚類健康食品的加工制造具有重要的指導意義。

1 多酚與蛋白相互作用

食品中多酚根據分子質量大小及結構的不同，可以分為兩大類，即多酚單體和多酚低聚或多聚體。多酚單體主要為酚酸類(如沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸和鞣花酸等)和黃酮類化合物。黃酮類化合物是由2個具有酚羥基的苯環(A環和B環)通過中央三碳原子(C鏈)連結組成C6-C3-C6基本碳骨架的一類化合物，根據各環上羥基結合的數目和位置、B環的結合位置、C環是否閉合、是否有雙鍵、聚合度等差異進一步細分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇(兒茶素)、異黃酮、花青素類等。多酚低聚或多聚體為多酚單體的聚合物，包括水解型多酚如沒食子單寧和鞣花單寧等，以及縮合型多酚如原花青素等[4]。目前研究與多酚相互作用的食品蛋白主要集中在牛乳蛋白、大豆蛋白、小麥蛋白、蛋清蛋白和肌肉蛋白等，因蛋白二級結構及表面游離氨基酸不同，其相互作用存在較大差異，有研究表明蛋白表面脯氨酸含量越高，更易于同多酚結合[5]。受多酚的多反應活性、蛋白的高度復雜性以及多酚與蛋白種類及反應條件不同的影響，多酚與蛋白之間的相互作用會發生不同程度的改變。多酚結構和環境條件的改變使得對蛋白多酚相互作用的評估更加復雜。目前多酚與蛋白之間的相互作用主要有兩類：非共價相互作用和共價相互作用。通常情況下非共價相互作用是可逆的結合過程，相對較弱，而共價相互作用為不可逆的強結合過程，2種結合作用對多酚和蛋白質性質可能產生不同的影響。迄今為止，有關多酚和蛋白質的相互作用研究基本集中在室溫和人體生理環境等相對較溫和條件下的相互作用，并且主要是以非共價作用為主，共價結合作用報道較少[6]。多酚與蛋白相互作用表征方法主要有熒光光譜、圓二色譜、等溫滴定量熱、紅外光譜、飛行時間質譜、傅里葉紅外光譜、電泳等[7-9]。

1.1 非共價作用

多酚與蛋白之間的非共價作用主要發生在溫和條件下，如自然生理條件(植物細胞內部環境、人體體內環境)以及食品中的一些中低溫處理過程，例如巴氏殺菌、預熱處理，主要包括氫鍵、靜電吸附、疏水相互作用和范德華力。氫鍵是多酚上的羥基與蛋白質親水基團(含N、O或S側鏈基團)結合而形成；靜電吸附是多酚類物質通過正負離子交換而吸附到蛋白質分子表面，作用強度較弱；疏水相互作用是非極性基團與非極性基團產生的作用力，作用力較強[10]。其中疏水相互作用和氫鍵是多酚和蛋白質發生非共價結合時的主要作用力。HASLAM等首先提出蛋白質與多酚是以疏水作用和多點氫鍵結合的“手套—手”反應模式理論：多酚分子的非極性基團向蛋白質分子表面靠近并進入蛋白質分子中疏水基團較集中的部位，然后發生多點氫鍵結合[11]。劉勤勤等研究了茶多酚與大豆分離蛋白反應的作用力主要是范德華力和氫鍵，茶多酚與大豆分離蛋白中色氨酸殘基發生反應，造成大豆分離蛋白親水基團暴露，引起大豆分離蛋白的二級結構發生改變[12]。肖建波采用熒光光譜，紅外光譜等測定了葛根素和牛血清白蛋白之間的相互作用，研究表明，葛根素進入到牛血清白蛋白分子的內部，形成了葛根素-牛血清白蛋白的配合物從而導致內源熒光淬滅，葛根素和牛血清白蛋白之間主要是疏水相互作用[13]。

通常情況下非共價鍵作用強度低，容易形成和打開，但多酚-蛋白質非共價相互作用可能導致蛋白質溶解度降低，形成聚集和沉淀，或者對多酚降解產生抑制或促進作用，對多酚分子結構本身無顯著影響。綦菁華等采用模擬體系研究發現兒茶素和麥醇溶蛋白聚合主要通過疏水鍵和氫鍵連接，濁度增加，并認為蛋白質和酚類聚合會使濃縮蘋果汁發生二次渾濁[14]。O’CONNELL等報道，由于兒茶素和β-乳球蛋白間的非共價相互作用，低濃度的兒茶素對β-乳球蛋白溶液的發泡能力和泡沫穩定性有所改善[15]。PRIGENT等發現，牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)和α-乳清蛋白與綠原酸非共價結合對蛋白的溶解度無任何顯著影響[16]。相反，乳清蛋白與花青素的非共價結合可以顯著降低熱、光和酶對葡萄皮花青素的降解作用，且經加熱預處理的乳清蛋白對花青素的保護作用優于未加熱蛋白，其保護機理可能為蛋白與多酚之間的非共價作用打開需要一定能量，在一定加熱條件下并不能完全打開，結合多酚未被降解，達到保護多酚的目的[17]。目前研究的蛋白多酚非共價相互作用主要是在體外溫和條件、體內消化環境、血液循環環境下的作用，在食品加工環境條件下相互作用的研究較少，尤其是經過高溫熱處理、高壓處理及其他加工技術處理后，體系中蛋白多酚相互作用的變化不清楚，作用機理尚不明確。雖然本實驗室徐潔瓊等[18]針對奶茶體系不同熱處理條件下多酚與蛋白相互作用做了些分析，發現茶多酚與蛋白之間的相互作用與蛋白種類及熱加工條件密切相關，經熱處理后茶多酚與蛋白非共價鍵作用類型和強度均發生不同程度的改變，但是是否有共價作用存在沒有進一步分析，熱加工導致的多酚蛋白作用發生變化的規律及內在的分子機制仍不明確。

1.2 共價作用

目前研究顯示，多酚與蛋白的共價結合可能發生在堿性、氧化酶存在以及高溫處理等條件下。在堿性條件下，多酚會裂解以及被氧化成不同形式活躍的親電性鄰醌結構，鄰醌環與蛋白的亞氨基或者巰基結合，形成不可逆的共價鍵[19]。NIKIFORIDIS等研究了在堿性條件下向日葵蛋白分離物與綠原酸的反應，發現蛋白分離物和綠原酸形成有色共價復合物，且共價結合程度與綠原酸用量成正比關系[20]。在高溫處理以及極端處理(如高壓均質等)條件下，多酚會發生氧化和裂解，蛋白的二級結構也同時改變，氨基酸暴露程度增加，多酚與蛋白之間生成不可逆的化學鍵[21]。BUDRYN等在90 ℃條件下觀察到咖啡提取物與牛奶蛋白之間有少量共價鍵生成[22]。另外，在有氧及氧化酶存在條件下，多酚被氧化成醌，從而與蛋白親核加成，形成不可逆的化學鍵。PRIGENT等研究表明多個綠原酸(chlorogenic acid, CA)可以同時與1個蛋白質分子反應，蛋白與醌的共價作用不僅可能發生在伯氨基上，還可能與半胱氨酸，色氨酸和組氨酸殘基的側鏈發生作用，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)氧化CA的反應中，溶菌酶的存在會誘導低二聚體形成[23]。綜上所述，多酚和蛋白共價結合程度受外界條件及自身結構影響較大。

多酚與蛋白之間的共價作用對多酚結構無顯著影響，但是會對蛋白的熱穩定性、乳化性等界面性質以及蛋白質功能及消化率和抗原性產生很大的影響，同時多酚蛋白共價復合物的抗氧化性等功能性質也會發生改變[24-25]。O’CONNELL等認為多酚與牛奶蛋白的共價結合可以提高牛奶的熱穩定性[26]。NIKIFORIDIS等通過向日葵蛋白分離物與純綠原酸的共價結合改變了蛋白質表面的疏水性分布[20]。WU等通過MALDI-TOF-MS和SDS-PAGE研究證明多酚與乳球蛋白的共價作用是通過氨基酸側鏈的巰基結合而發生的，多酚與乳球蛋白的相互作用降低了β-乳球蛋白的過敏性和改善其功能特性[24]。LIU等在乙醇-水溶液中研究了玉米醇溶蛋白(zein)與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)和綠原酸的相互作用，證明了zein-EGCG共價復合物比非共價復合物具有更高的熱穩定性和更強的抗氧化活性[27]。目前，對于多酚與蛋白之間共價連接的分析研究依舊處于起步階段，對于連接方式可能是氨基或者巰基的連接或者加成只是系列實驗的推測結果，尚未分離出純共價結合的產物，未觀察到多酚與蛋白分子或者原子結合的構象圖，所以對于多酚與蛋白究竟如何共價連接，作用位點、作用環境以及結合強度如何尚不清楚，是今后多酚與蛋白相互作用研究的一個重要方向。

2 多酚與蛋白相互作用對多酚生物可利用性的影響

2.1 多酚生物可利用性

生物可利用性是反映食品中營養和活性組分進入人體內并被吸收利用的難易程度，是營養和活性組分對人體發揮健康功效的前提性條件[28]。多酚的生物利用過程包括人體進食含多酚的食品后，酚類成分經口腔、胃、腸等消化從食品基質中釋放出來，然后被腸道表皮細胞吸收進入血液循環分布到達人體不同靶向器官，并經代謝最終排出體外整個過程[29]。生物利用度的高低對于多酚在人體內發揮生理作用和健康功效至關重要。然而目前許多研究顯示，食品中的多酚類成分生物利用率較低，很多在10%以下，這嚴重制約了多酚類物質功能活性的體現及對人體健康的作用。影響食品多酚生物可利用性的因素主要有以下幾方面：(1)多酚自身結構特征，包括聚合度、羥基化、甲基化、甲氧基化、酯化度以及酰基化等，結構特性不同，多酚生物可利用性存在很大差別[30]；(2)食品中其他營養成分，如蛋白質、脂肪碳水化合物等[31]生物大分子會與多酚發生相互作用，從而導致多酚的生物可利用性發生改變[32]；(3)腸胃消化生理條件，胃消化和腸道過渡環境導致多酚結構發生改變，從而致使多酚的生物利用度發生改變；(4)加工條件，通常情況下熱處理強度越大，多酚因穩定性差而發生降解，從而導致多酚的生物可利用性降低[33]。堿性條件會使多酚結構發生改變，穩定性降低，生物可利用性降低[29]。多酚經消化和吸收后化學結構的變化很可能會影響它們的生物活性，因此多酚在消化系統中的生物可利用性和代謝決定了它們對機體的作用大小。生物可利用性可以通過使用體外模擬消化系統模型、細胞實驗、動物實驗和人體臨床實驗來確定，從而評估多酚在體外胃腸道以及動物和人體內的穩定性和生物可利用度[34]。目前提高多酚生物利用性的方法主要包括采用新型的載運系統(如微乳、納米膠粒、脂質體等)提高酚類在小腸的吸收率[35-36]，對酚類進行結構修飾提高其在消化、代謝中的穩定性[37]以及改變酚類吸收部位等[38]。

2.2 多酚與蛋白作用對多酚生物可利用性的影響

食品本身是一個多組分共存的復雜體系，其中蛋白質是食品重要的營養組分。有關食品基質中蛋白組分對多酚生物可利用性的影響研究目前仍然存在爭議。多酚與蛋白之間的相互作用受多酚和蛋白種類以及反應條件的影響較大，多酚類化合物與蛋白質相互作用可能會提高或降低多酚的生物利用性或者對其無顯著影響，其影響機理可能為蛋白與多酚結合后影響多酚類物質在胃腸道的釋放和吸收，從而導致其生物可利用性的差異。本實驗室劉嬋等研究奶茶模擬體系中茶多酚的生物利用性發現，在體外模擬消化環境下，茶多酚和乳蛋白、消化酶均存在非共價相互作用，且三者間的競爭相互作用隨多酚、蛋白和酶種類的不同而不同，對多酚生物利用性的影響也不同，當茶多酚-乳蛋白相互作用力大于茶多酚-消化酶時，茶多酚先與乳蛋白結合，隨后消化酶水解蛋白釋放茶多酚，從而提高茶多酚的生物可利用性。反之，若茶多酚-乳蛋白相互作用力小于茶多酚-消化酶時，茶多酚先與消化酶作用抑制消化酶活性，從而抑制蛋白水解，致使茶多酚與蛋白結合，降低茶多酚的生物可利用性[39]。DUFOUR等研究了水果和蔬菜中的多酚類物質與蛋白相互作用后在胃腸道消化吸收的生物可利用性，表明牛奶蛋白可以增加兒茶素的生物可利用性[40]。最近的一項研究還表明，向不同的乳制品中添加綠茶多酚可以增強多酚的穩定性和抗氧化活性。他們還指出，乳制品的物理狀態是影響多酚生物利用度的重要因素[41]。HELAL等通過研究肉桂飲料中多酚和肉桂醛的體外生物可利用性發現，添加牛奶對多酚生物可利用性沒有影響，添加牛奶蛋白質水解物可使多酚抗氧化活性增強[42]。ROURA等觀察到類似的結果，他們研究表明，牛奶對食用可可粉中多酚的生物利用度沒有顯著影響[43]。相反，GREEN等研究發現，兒茶素與蛋白質相互作用使兒茶素衍生物暴露于消化環境中，從而促進了兒茶素衍生物的降解，導致兒茶素的生物利用性降低[44]。本實驗室陶亞丹對果奶實際體系的研究發現，添加豆奶和牛奶對不同果汁(蘋果汁、葡萄汁、橙汁、柚子汁、獼猴桃汁)中多酚的體外生物可利用性影響不同，添加牛奶可提高葡萄汁、橙汁、柚子汁和獼猴桃汁中總多酚生物利用率13.3%～62.7%，而對蘋果汁多酚生物利用性沒有顯著影響；添加豆奶可提高橙汁和獼猴桃汁多酚的生物利用率20%左右，但使蘋果汁和柚子汁多酚生物利用率分別下降26.3%和14.9%，而對葡萄汁多酚生物利用性無顯著性影響[17]。牛奶蛋白組分影響多酚生物可利用性結果存在明顯差異，除了與采用的生物可利用性體外和體內模型測試方法存在一些差別有關外，很可能主要是由不同體系中蛋白質與多酚分子相互作用的不同從而引起多酚釋放和吸收不同所致[45]。

實際上，多酚與蛋白質的結合方式、結合位點和結合強度大小受多種因素影響，如多酚和蛋白質種類、分子結構、分子質量、活性基團、濃度比例以及溫度、pH、離子強度等外界條件等[46]。特別是在食品熱加工過程中，如熱燙、巴氏殺菌、高溫滅菌、蒸煮、烘烤、油炸等，多酚和蛋白質分子結構都會發生不同程度的變化，多酚與蛋白的相互作用形式和強度也必然發生不同程度的改變，從而對食品多酚生物利用性造成不同影響。目前關于多酚與蛋白相互作用對多酚生物利用性影響的研究報道不少，多數研究集中在溫和條件以及胃腸道消化環境下相互作用的影響，而在食品熱加工條件下的研究較少，雖然XIE等和本實驗室徐潔瓊等通過體外消化模型研究了熱處理對奶茶模擬體系茶多酚生物可利用性影響，并發現80 ℃加熱處理可以提高奶茶中茶多酚生物可利用性，而100 ℃熱處理會降低其生物可利用性[18,47]，但對于加熱條件下引起茶多酚生物可利用性發生改變的內在原因沒有解釋清楚，尤其是熱加工誘導的多酚和蛋白分子相互作用變化及其對多酚生物利用性的影響沒有進行深入研究。

3 展望

綜上所述，目前對于食品多酚與蛋白相互作用的研究基本限于溫和條件和生理條件下，在食品加工環境條件下研究較少，但食品經高溫加工處理后，多酚和蛋白質分子結構都會發生不同程度的變化，如多酚化合物在高溫下容易氧化并發生聚集或降解反應，蛋白質分子受熱后結構也會發生部分展開、變性及不同程度的聚集，因而多酚和蛋白質相互作用也將發生變化。熱加工處理后，食品多酚和蛋白相互作用到底發生怎樣的變化，存在哪些結合作用，除了非共價鍵外，有多少共價鍵結合的形成，熱加工強度與相互作用類型和強弱變化有何關系，多酚和蛋白相互作用的變化跟多酚生物利用性的改變之間存在怎樣的內在關聯，相關方面目前未見更深入的研究。因此，今后需要進一步研究闡明不同熱加工條件下多酚與蛋白質相互作用的模式及變化規律及其對多酚生物利用性的影響機制，這對于提高食品多酚的生物利用率和產品健康品質具有重要意義，將為多酚類健康食品的設計制造提供科學依據和理論指導。