益生菌噴霧干燥影響機制及優化策略分析

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉軍

1(湖南化工職業技術學院 制藥與生物工程學院，湖南 株洲，412004) 2(中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙，410004)3(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640)

益生菌(probiotics)是指具有維持人體內菌群平衡，對人體健康產生有益作用的微生態制劑。口服足量活性益生菌有助于緩解急慢性胃腸炎、治療腹泄、改善消化，緩解乳糖不耐癥等癥狀[1]。Science和Cell等國際頂級期刊發表論文指出，特定益生菌及腸道菌群在減少病原菌在腸內定植和生長、提升免疫力、緩解神經發育障礙等方面具有顯著功能[2-3]。常見益生菌主要源自革蘭氏陽性的乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、雙歧桿菌屬及部分酵母，其菌體制劑分為液體制劑和固體制劑。前者是通過傳統發酵培養并最終獲得益生菌菌液作為制劑產品，后者則由益生菌經增殖后，通過凍干、噴霧干燥或包埋等手段加工成固體制劑形式。液態制劑隨著保藏時間延長易受污染或菌種退化，使用前需活化培養和擴大培養，而固態菌劑可直投，發酵前不需擴大培養，保藏費用較低。目前，益生菌固體制劑工藝常有真空冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、微波真空干燥等。真空冷凍干燥適用熱敏性益生菌干燥，菌體亞細胞損傷少、活菌率高，但易受預凍溫度、冷凍速度和真空度等因素影響，耗時長、費用高；流化床干燥干燥時間較長，當物料停留時間不均勻時，存在干燥不均勻等情況；微波真空干燥通過極性分子(如菌體水分)隨微波頻率做同步高速旋轉，物料瞬時產生摩擦熱，導致物料表面和內部同時升溫，使大量菌體水分子逸出，實現干燥，但存在微波分布不均勻，溫度一致性不好等問題，且無法實現規模化操作。噴霧干燥是直接將制備好的菌懸液經過霧化裝置噴霧成霧狀，并在干燥室內與高溫空氣直接接觸進行傳熱傳質，干燥時間極短，物料溫度較低，產品分散性和溶解性較好，過程簡單，設備成本相對較低，特別適用于工業化連續生產，在藥品、食品領域被廣泛使用[4]。本文回顧了益生菌噴霧干燥的基本原理，對影響噴霧干燥因素進行系統而全面的分析，并提出益生菌噴霧干燥工藝優化策略，以期促進噴霧干燥技術在益生菌干燥中的應用。

1 益生菌噴霧干燥基本原理

噴霧干燥法是將擬干燥的益生菌菌體霧化成非常細微的霧滴，并依靠干燥介質(如熱空氣)與益生菌霧滴均勻混合，通過熱質交換使溶劑氣化從而獲得干燥的益生菌菌體。典型生產工藝如圖1所示[4]。

圖1 典型噴霧干燥器的結構示意圖Fig.1 Typical structure sketch of spray dryer

具體噴霧干燥過程如下：經增殖培養的益生菌菌體經預處理后由料泵從塔頂進入噴霧干燥塔，由噴頭霧化為直徑約20～100 μm的益生菌液滴并與熱空氣(120～180 ℃)接觸。進入噴霧干燥塔的熱空氣經除濕、加熱后由干燥塔頂端進入塔內并與霧化的益生菌液滴進行順流干燥。由于益生菌菌體微小，具有極大的比表面積，與熱空氣有良好的熱質交換，可在幾秒至幾十秒內迅速脫水干燥，從而制備成益生菌菌粉；益生菌菌粉隨后進入袋式過濾器，廢空氣則由過濾器頂端排出，實現空氣與益生菌干菌體的分離。菌體由袋式過濾器收集后直接制備成益生菌菌粉。部分益生菌菌體經袋式過濾器分離后水分達不到質量要求，可進入流化床干燥器進一步除去水分，再制備成益生菌菌粉。噴霧干燥作為一種常用的干燥技術，在條件優化情況下，可進行幾十毫升至幾噸的物料干燥。

2 益生菌噴霧干燥影響因素分析

研究益生菌菌體存活率的影響因素對保護益生菌和減少益生菌生理功能的損失具有重要作用[5]。

2.1 益生菌菌株本身

益生菌在極端條件或受熱條件下可誘導產生熱激蛋白，與益生菌菌體熱耐受性有重要關系。一般對數生長末期和穩定期菌體的熱耐受性較好，通過預處理可提高益生菌菌體耐受性。DESMOND等將L.rparacaseiNFBC338用0.3 mol/L NaCl預處理30 min增強了菌體耐受性[6]；陸英等[7]將7 h菌齡的酪乳桿菌L.caseiBD- Ⅱ50 ℃預處理45 min，菌體熱耐受性提高了2.11倍；TEIXEIRA等[8]對處于不同生長階段的L.bulgaricus進行熱激處理并研究了存活率，發現穩定期菌體熱耐受性比對數生長期菌體要好，對數生長期菌體存活率相對穩定期要低[9]。GOLOWCZYC等在相同噴霧干燥條件下對CIDCA 83114、L.kefirCIDCA 8348和S.lipolyticaCIDCA 812三株乳酸菌耐熱性進行對比分析，研究發現，3株乳酸菌表現不同耐熱性，其熱耐受性存在顯著差異[10]；CORCORAN等[11]對比分析了L.rhamnosusE800、L.salivariusUCC500和L.rhamnosusGG的耐熱性，發現益生菌菌體熱耐受性存在差異，L.rhamnosusE800熱耐受性最好；YANG等[12]對比分析了Mg2+對益生菌L.rhamnosusGG,L.caseiZhang和L.plantarumP-8熱耐受性的影響，研究發現，Mg2+能提高這3株乳酸菌的熱耐受性，特別是L.rhamnosusGG，Mg2+在20 mmol/L條件下，L.rhamnosusGG存活率提高了近100倍，且熱誘導熱激蛋白時間明顯縮短。由此可見，由于菌株生理特點不同導致菌體熱耐受性有一定區別，菌體熱耐受性可通過不同方式進行熱誘導來提升。

2.2 培養基成分

在益生菌培養基中添加特定成分(如糖、氨基酸等)可提高益生菌菌體存活率，主要是由于在高熱和低水分條件下微生物可產生可溶性物質來減少因滲透壓改變造成的亞細胞損傷。需注意的是，乳酸菌無法合成這類可溶性物質，在乳酸菌培養過程中添加這些物質可減少乳酸菌細胞膜亞細胞結構的熱損傷。CARVALHO等[13]和SILVA等[14]認為在培養基中添加乳糖和蔗糖可增強菌株熱耐受性和提高噴霧干燥過程中活細胞耐熱性和存活率。不同糖類代謝產物對益生菌保護作用有顯著差異。如P.aeruginosa發酵蔗糖和果糖產生的甘露醇在低水分條件下可減少益生菌菌體受到熱損傷；乳酸菌可利用乳糖和蔗糖等產生表多糖(EPS)黏附在細胞壁上減少乳酸菌熱氧化損傷[15]。KETS等[16]認為，在培養基中添加甜菜堿可增強益生菌的耐熱性，能減少高溫和干燥脫水對亞細胞結構的損傷。CORREA等[17]研究了L.rhamnosusCRL1505的熱耐受性，在磷酸緩沖溶液中55 ℃熱誘導20 min比60 ℃熱誘導5 min能更好地提高菌體的熱耐受性，在含10%脫脂奶粉的培養基中加入KH2PO4, Na2HPO4, MnSO4和MgSO4等無機鹽能提高菌體存活率，并利用TEM監測了細胞形態的變化。研究認為，在無機鹽和高濃度多磷酸鹽存在情況下，能提高益生菌菌體對熱激的耐受性。

2.3 保護劑

在噴霧干燥過程中添加保護劑是益生菌菌粉制備中的常用策略，可分為單一型保護劑(如葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、枸杞多糖等)和復合型保護劑(如蔗糖+麥芽糊精等)。由于海藻糖在失水部位以氫鍵和磷脂極性端相連，防止膜相變和復水時滲漏，可起到保護益生菌的作用；AGUDELO等[18]以乳清分離蛋白和麥芽糖糊精作為載體，對比研究了膠囊化的L.rhamnosus益生菌在有蔗糖或海藻糖保護劑及無保護劑的條件下的生存活性，研究認為，在蔗糖或海藻糖的保護作用下，益生菌的生存活性明顯得到改善。復合型保護劑如蔗糖+麥芽糖糊精可將L.bulgaricus噴霧干燥后菌株存活率由0.01%提高到7.8%[19]。復合型保護劑成分一般為脫脂乳、阿拉伯膠、谷氨酸鈉和淀粉等[20]。SALAR-BEHZADI等發現，以阿拉伯膠+明膠或果膠作為復合型保護劑時，可提高B.bifidumBB-12存活率[21]。因為阿拉伯膠+果膠可增強細胞膜中磷脂氫鍵穩定性，明膠可在干燥后形成熱可逆凝膠膜，保護菌體免受高溫脫水傷害；SANTIVARANGKNA等研究發現，菊粉+果糖可增強B.bifidumBB-12耐熱性，并能抵御口服后胃液對益生菌定植的影響，但不宜過量，否則會因糖分過高造成干燥困難[22]；ANANTA等[5]研究了脫脂奶粉對益生菌LGG(標準株53103)噴霧干燥的保護作用，研究認為，以復合保護劑低聚果糖+聚葡萄糖代替部分脫脂奶粉能提高益生菌存活率。張建峰等[23]研究了不同保護劑對益生菌釀酒活性干酵母活菌率的影響，研究發現，以20 g/L司班-60+20 g/LTween- 80作為保護劑時活菌率達77.89%，以50 g/L海藻糖+20 g/L司班-60+20 g/LTween-80作為生產用保護劑，活菌率可達(83.52±1.87)%。

2.4 益生菌菌體微膠囊化

將益生菌進行微膠囊化能提高益生菌的細胞穩定性和生產率[24]。IPAILIENé[25]認為在微膠囊化過程中，益生菌存活率受微膠囊化方法、壁材、菌體類別、溫濕度、水分活度、pH、氧氣和壓力等諸多因素的影響，微膠囊的表面結構對于益生菌的存活率也存在一定的影響。KAILASAPATHY等[24]認為，微膠囊化能提高菌體的存活率，但在微膠囊化時，需考慮食品基質對存活率的影響，此外，食品pH、食品基質的組織結構以及脂肪含量等對于增強菌體存活有重要影響。SHORI[26]將益生菌微膠囊化，可增強益生菌抗胃酸破壞能力，有利于益生菌在胃腸道的定植；SURONO等[27]研究認為，微膠囊化能提高益生菌L.plantarumIS-10506的存活率；黃樂天等[28]研究了微膠囊化的蠟樣芽孢桿菌噴霧干燥工藝參數，在優化條件下，存活率高達81%；李寧等[29]以明膠為壁材，優化了雙歧桿菌(B.bifidusBBM)噴霧干燥工藝參數，優化條件下微膠囊產率為65.7%，活菌存活率為53.5%，活菌數超過了1×1010CFU/g；譚文樂等[30]研究了醋酸菌噴霧干燥工藝，當進風溫度為107.7 ℃、進樣速度為11.09 mL/min、 壁材β-環糊精與阿拉伯膠之比為8.7∶1.3(質量比)、 壁材質量濃度為75.9 g/L時，醋酸菌存活率為23.1%， 醋酸菌的活菌數為3.8×109CFU/g；羅佳琦等[31]采用噴霧干燥技術將嗜酸乳桿菌制成微膠囊，通過正交實驗得到最佳的處理條件，在進風溫度140 ℃，進料速度14.58 mL/min時，以配比為1∶10(質量比)的阿拉伯膠和麥芽環糊精為壁材，添加濃度為200 g/L條件下，嗜酸乳桿菌微膠囊活菌數達到了108CFU/mL，存活率達到了63%；BUSTAMANTE等[32]考察了植物黏液、麥芽糊精與可溶性蛋白質作為微膠囊化壁材對B.infantis和L.plantarum噴霧干燥后菌體生存活性的影響，研究認為，這2株益生菌在復合載體的保護作用下，保存期間生存率超過98%。

2.5 噴霧干燥工藝參數

2.5.1 出口溫度

噴霧干燥可分為恒定干燥和降速干燥2個連續的干燥階段，第一階段益生菌菌體含水量高，干燥過程對益生菌亞細胞結構損傷較少；第二階段菌體含水量較低(外高內低)，益生菌微粒表面形成“玻璃體”，干燥速度變得十分緩慢，若噴霧干燥的出口溫度過高，將會對菌體產生熱脅迫，造成亞細胞結構和生物大分子的損傷[33]。BOZA等研究了出口溫度對Beijerinckiasp.菌體存活的影響，研究發現降低出口溫度有利于減輕對菌體亞細胞結構的損傷，菌體存活率與出口溫度呈負相關[34]；郭云等[35]將發酵乳桿菌KLDS1.0709用脫脂牛奶作為基質制備得到菌懸液，并添加不同比例的蔗糖與海藻糖研究噴霧干燥出口溫度對菌體存活的影響，結果表明，出口溫度的升高降低了菌體存活率，以100 g/L脫脂乳+50 g/L海藻糖+50 g/L蔗糖為基質進行噴霧干燥，菌體存活率高達73.90%；PARASTIWI等[36]為優化噴霧干燥操作和提高干燥效率，研究了噴霧干燥出口溫度的自動控制系統，以出口溫度作為評價參數與反饋控制變量，通過改變熱空氣流速或進口溫度等方式間接調節益生菌菌懸液的濕度，通過微控制器可較好地實現噴霧干燥出口溫度的調節。

除了出口溫度外，進料流速、氣流速度、物料濃度和干燥時間等對出口溫度有重要影響，但目前未發現有研究這些參數與出口溫度變化關系的文獻報告。對噴霧干燥過程參數進行優化可減少菌體亞細胞結構與生物大分子的損傷，提高益生菌菌體的存活率。值得注意的是，出口溫度不能過低，否則干燥不徹底，影響菌體的保存與菌體形貌。

2.5.2 噴霧壓力與離心盤轉速

壓力噴霧干燥法的噴霧壓力和離心噴霧干燥法的離心轉盤轉速對噴霧干燥有重要影響。對于壓力噴霧干燥來說，降低噴霧壓力，益生菌的亞細胞結構與生物大分子損傷減少，能保持較高的存活率。RIVEROS等[37]研究了噴霧壓力對L.acidophilu益生菌存活率的影響。研究發現，噴霧壓力由100 kPa降低至50 kPa時，存活率可提高10%。主要原因是由于噴霧壓力降低，作用于益生菌菌體的剪切作用力減弱，從而對亞細胞結構損傷明顯降低；KIM等[38]和ZHOU等[39]也得到類似的研究結論。但需注意的是，噴霧壓力不能過小，否則益生菌菌懸液無法實現良好的霧化，從而形成菌團，使干燥時間延長。對于離心噴霧干燥來說，霧化效果與離心盤轉速有直接關系，離心盤轉速快時，霧化效果較好。但值得注意的是，離心盤轉速過快容易對益生菌菌體產生極大的剪切作用力，在熱脅迫的協同作用下，對益生菌細胞壁和細胞膜等亞細胞結構及胞內生物大分子均可造成可逆或不可逆損傷，影響了菌體存活率。為平衡離心力與干燥效果的關系，常控制離心轉盤轉速在3 000～20 000 r/min較為理想。離心轉盤轉速也不宜過低，否則霧化效果較差，易形成菌團，干燥時間較長。

2.5.3 聯合其他干燥工藝

當單獨采用噴霧干燥無法達到質量要求時，可考慮與其他干燥工藝聯用，這樣可以適當降低噴霧干燥的出口溫度，從而減少對益生菌菌體的熱脅迫和熱氧化損傷，提高菌體存活率。DONZ等[40]采用噴霧干燥與流化床聯用進行菌體噴霧干燥(工藝過程如圖1)，結果表明，該工藝得到的菌體分散性較好。這種聯用干燥工藝比單純采用噴霧干燥效果要好，是目前應用較為廣泛的益生菌干燥策略。

2.6 復水條件

益生菌菌粉使用之前需復水才能恢復其生物活性，復水條件對益生菌菌體存活率有重要影響，復水溫度是最為關鍵的參數，而復水介質對益生菌菌體影響較少[41]。WANG等研究了L.bulgaricus的復水條件，發現復水溫度由4 ℃提升到50 ℃可明顯提高菌體存活率和益生菌數量；TEIXEIRA等[42]也得到類似的結論，復水溫度的提高，能提高S.thermophilus和B.longum活菌數。需注意的是，復水溫度不宜太高，否則會造成菌體生物大分子變性，影響菌體活菌數。

2.7 貯藏溫度、貯藏時間和包裝方式

菌體在低溫條件下可降低其生理活性，有利于菌種的保存，貯藏溫度對益生菌存活有重要影響[43]。MORGAN等[44]研究了抗氧化劑(VC和谷氨酸鈉)在低溫條件下對L.delbrueckiissp. Bulgaricus抗氧化的影響，結果表明，低溫條件下可減少細胞膜脂肪酸氧化和過氧化物產生，保護細胞內生物大分子，有利于菌體生物活性的保存[5]；益生菌存活率與貯藏時間也有一定的關系。通常情況下，隨著貯藏時間的延長，益生菌的存活率有不同程度的下降；益生菌包裝方式對存活率也有影響，采取隔絕氧氣保存(如充入惰性氣體N2或真空保存)能提高益生菌的存活率，特別是真空保存效果更佳。

3 提升益生菌噴霧干燥活菌率的優化策略

為提升噴霧干燥后益生菌菌體存活率，可從以下3個方面進行優化：提升益生菌菌體熱耐受性，優化噴霧干燥參數和使用保護性載體進行保護。

3.1 誘導和預處理提升益生菌菌體熱耐受性

由于種屬的差異性或同種屬益生菌的生理差異，在相同噴霧干燥條件下常表現不同的耐受性并表現不同的存活率。如乳桿菌L.rhamnosus在相同噴霧干燥條件下，菌株GG比E800表現更強的熱耐受性[45]；雙歧桿菌屬的嬰兒雙歧桿菌B.infantis和長型雙歧桿菌B.longum在相同噴霧條件下也表現2倍差異的存活率[46]；HUANG等[47]用300 g/L甜乳清培養L.casei與P.freudenreichii并對耐受性相關成分進行分析，結果發現，甜乳清既可作為培養基質，還可起保護作用。在實驗室規模和小試噴霧干燥過程中，菌體存活率可接近100%，對P.freudenreichii進行耐受性分析發現，噴霧干燥過程中應激蛋白呈現高水平表達，表現較好的熱耐受性；DIJKSTRA等[48]研究了溫度、pH、溶氧和鹽濃度等對L.lactis脅迫的影響，發現不同菌體熱脅迫和氧化脅迫有3個數量級區別。基因轉錄分析發現，溶氧改變可誘導Met和Cys代謝相關基因的高通量表達[48]。

對菌體進行亞致死劑量脅迫預處理可誘導菌體應激蛋白的表達。DESMOND等[49]將L.paracasei于52 ℃預處理15 min后并將菌體于60 ℃熱處理，菌體存活率提高了300～700倍，噴霧干燥后菌體存活率提高了18倍；高滲透性預處理也可以提高菌體對脅迫的耐受性，并與熱脅迫有交叉保護的作用。需注意的是，對菌體進行熱脅迫或滲透壓脅迫雖能提高菌體耐受性，但要注意熱脅迫時的溫度與滲透脅迫的滲透壓，否則可能造成益生菌菌體不可逆損傷；已進行過熱預處理的菌株是否還能繼續進行熱脅迫仍需深入研究，目前未見文獻報道，對脅迫機理研究目前也鮮有報道。開展菌體耐受性機制研究有利于更深入地了解噴霧干燥對菌體的亞細胞結構及生物大分子的損傷，從而有利于優化噴霧工藝并獲得高活性的益生菌菌體。

3.2 優化噴霧干燥參數

研究噴霧干燥對菌體亞細胞結構及生物大分子的影響，優化噴霧干燥參數是益生菌噴霧干燥的重要研究內容，也是正確設定噴霧干燥工藝參數的關鍵所在。噴嘴類型、進口溫度、熱空氣流速、進料液流量、出口溫度等對菌體存活率有重要影響。普遍認為，噴霧干燥出口溫度過高對于保持菌體高存活率有負面影響[50]；出口溫度受進口溫度、熱空氣流速、益生菌菌液的流速等綜合影響[38]。在保證益生菌干粉回收率的前提下，降低噴霧干燥出口溫度有利于提高菌體存活率；改變霧化液滴大小、空氣進風分布、進料液流量等可降低出口溫度[4]。若菌體顆粒較大或水分含量過高，無法通過噴霧干燥達到質量標準時，可與其他干燥技術聯用，如先采用噴霧干燥形成顆粒，移除大部分水分，再通過流化床干燥移除殘存水分。ADOLFO等[51]采用噴霧干燥與流化床干燥聯用進行了益生菌菌粉制備研究，結果表明，多級干燥可達到近100%的菌體存活率。

3.3 使用保護性載體

在噴霧干燥過程中，加入特定的載體可以實現對益生菌的保護，其保護機制有[4]：

(1)提高益生菌亞細胞結構穩定性和改善菌體耐受性[52]。包埋在保護載體內的益生菌可減少脅迫對菌體的損傷。海藻糖就是常見的保護性載體。HERDEIRO等通過改變S.cerevisiae培養條件使細胞內積累海藻糖，能提高存活率，因為海藻糖可在熱脅迫下保護酵母核糖體等亞細胞結構穩定性，還能減少氧化脅迫造成細胞膜脂質過氧化[53]；金屬陽離子(如Ca2+、Mg2+)能提高益生菌熱脅迫耐受性。ZHENG等[54]研究了Ca2+在乳糖與海藻糖保護劑存在的情況下對益生菌的保護機制。乳糖+Ca2+能極大改善益生菌熱耐受性。海藻糖+Ca2+得到相反結論，并認為單純海藻糖能起到更好的保護作用；Mg2+也能起到良好的保護作用，因為Mg2+能較好地降低核糖體在噴霧干燥熱脅迫中的損傷，對菌體內穩態維持有重要作用[12]。YANG[12]研究了Zn2+、Na+和Mg2+對益生菌L.rhamnosusGG,L.caseiZhang和L.plantarumP-8熱耐受性的影響，研究發現，10～50mmol/L濃度的Mg2+能提高乳酸菌株的熱耐受性，20 mmol/L的Mg2+能提高約100倍的L.rhamnosusGG存活率，且能縮短熱誘導期。

(2)使用保護載體。目前，主要應用的保護載體為牛奶蛋白質，主要是由于牛奶蛋白質可在益生菌菌體表面形成保護膜，能“隔絕”外界不利因素對益生菌菌體的脅迫[48]。SONG等[55]在脫脂奶粉中加入Ca2+并采用熱處理使牛奶蛋白質變性凝聚。結果發現，相對于未處理的脫脂奶粉，脫脂奶粉加入Ca2+并進行熱凝聚可提高益生菌2個數量級的存活率；WANG等[56]也發現鈣凝聚牛奶作為干燥載體也具有優秀的保護作用；KHEM等[57]發現分離乳清蛋白也可起到良好的保護作用，主要是由于蛋白質分子與細胞表面疏水鍵結合形成保護層，可以緊密包埋益生菌菌體[54]。此外，也發現其他材料也可作為噴霧干燥的保護性載體，如酪蛋白酸鈉、甘油、明膠、氨基酸等也可作為菌體活性保護劑，但其抗熱保護效果目前研究較少。目前，幾乎所有微生物細胞干燥都添加了保護載體。保護劑可改變微生物干燥時的物理、化學環境，減輕或防止干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性。保護劑不僅影響益生菌存活率，還影響益生菌儲存期間的生產穩定性。為提高益生菌的保護效果，常使用復合型保護載體。范娜等[58]選取海藻糖、明膠和甘油作為保護劑，研究其對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護效果。結果表明，3種保護劑之間存在交互作用，復合使用時的抗熱保護效果比單獨使用時好，最佳復合配方為海藻糖160 g/L、甘油60 g/L、明膠1.4 g/L， 菌體存活率可達16.58%，活菌數為1.66×108CFU/mL。