液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)牙鲆魚(yú)中的小清蛋白過(guò)敏原

葛敏敏，王建華，林洪

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島， 266003)2(青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島，266002)

小清蛋白(parvalbumin，PV)是水產(chǎn)品中的主要過(guò)敏原，在真骨魚(yú)類中廣泛存在，其對(duì)溫度、pH和變性劑都較為穩(wěn)定，因此很多加工過(guò)的魚(yú)類產(chǎn)品仍具有致敏性。魚(yú)類肌肉中小清蛋白的含量范圍為 0～1.5 mmol /L[1]，牙鲆的PV有3個(gè)亞基，本文只研究其中1個(gè)亞基G9I585(uniprot中PV編號(hào))，對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。

“bottom up”[2]的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，其一般過(guò)程為：首先利用酶將目標(biāo)蛋白質(zhì)切成小分子質(zhì)量的肽段，然后通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)對(duì)肽段進(jìn)行檢測(cè)。HPLC-MS/MS分析方法的建立最好每個(gè)蛋白質(zhì)選 2～3 個(gè)特征肽段，以獲得更好的特異性[3]，一般選用胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，產(chǎn)生的肽羧基末端通常為精氨酸或賴氨酸，經(jīng)ESI源離子化后主要產(chǎn)生帶有2個(gè)正電荷的離子，二級(jí)質(zhì)譜碎裂時(shí)產(chǎn)生的子離子一般為Y型離子帶有1個(gè)正電荷[4]。目前“bottom up”方法逐漸應(yīng)用于牛奶[5]、雞蛋、魚(yú)類[6]、甲殼貝類動(dòng)物[7]、堅(jiān)果[8]、小麥、花生[9]等主要致敏原的檢測(cè)，相比于傳統(tǒng)方法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)[10]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[11]，LC-MS / MS方法具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，因此LC-MS/MS將作為一種重要的過(guò)敏原檢測(cè)方法。

在真骨魚(yú)類PV的檢測(cè)方面，蔡秋鳳等[12-13]分別采用ELISA和Western-blotting 方法對(duì)不同加工方式的鰱魚(yú)的PV的含量變化進(jìn)行分析，CARRERA等[6]利用LC-MS/MS方法對(duì)真骨魚(yú)的PV進(jìn)行定性分析，但沒(méi)有進(jìn)行定量檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)利用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行特征肽段的篩選，選擇ALTDAETK、LFLQNFAFSASAR和SDFIEEDELK作為牙鲆PV的特征肽段，并對(duì)蛋白質(zhì)提取液體和酶解過(guò)程的吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic， IAA)濃度、酶用量、酶解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，建立了以ALTDAETK作為定量肽段，LFLQNFAFSASAR和SDFIEEDELK作為定性肽段的牙鲆PV檢測(cè)的LC-MS / MS方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)牙鲆中PV的精確定量。采用LC-MS/MS方法對(duì)牙鲆中PV的定量分析及對(duì)牙鲆PV的前處理優(yōu)化過(guò)程未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牙鲆、大菱鲆購(gòu)自山東青島。

LTDAETK(摩爾質(zhì)量:847.9 g/mol，簡(jiǎn)稱ALT)、SDFIEEDELK(摩爾質(zhì)量:1 224.3 g/mol，簡(jiǎn)稱SDF)、LFLQNFAFSASAR(摩爾質(zhì)量:1 253.4 g/mol，簡(jiǎn)稱LFL)、SDFIEEDELK(摩爾質(zhì)量：605.8 g/mol，簡(jiǎn)稱sdf)、重組PV(摩爾質(zhì)量:11 645.0 g/mol)，委托上海Sangon Biotech公司合成(純度>95%)；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，瑞士Roche公司；二硫蘇糖醇，北京Solarbio公司；吲哚-3-乙酸，北京Solarbio公司；Rapigest SF，美國(guó)Waters公司；Tris(分析純)，北京Scientan公司；甘氨酸(分析純)，北京Solarbio公司；EDTANa4(分析純)，天津Kermel公司；乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純)，德國(guó)Fluka公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200/6430液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；UPLC-Q-Exactive Focus MS超高效液相色譜四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；BEH-C18色譜柱，美國(guó)Waters公司；HS501水平振蕩器，德國(guó)IKA公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；調(diào)速形迷你離心機(jī)，上海Sangon Biotech公司；Mill-Q超純水裝置，美國(guó)Millipore公司；HH-1水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組PV的酶解

前處理：取10 μL重組PV水溶液(8 μg/mL)，加入90 μL Rapigest SF(0.1%，體積分?jǐn)?shù))，加入30 μL IAA(濃度5 mol/L) 溶液，40 ℃避光水浴30 min； 加入20 μL胰蛋白酶溶液(質(zhì)量濃度0.1 mg/mL)，加入水使酶解液體積達(dá)到198 μL，酶解14 h，加入2 μL甲酸終止酶解，12 000 r/min離心30 min后，取上清；進(jìn)UPLC-Q-Exactive Focus MS檢測(cè)。

1.3.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

提取：新鮮牙鲆取肌肉打碎，取1 g(精確至0.01 g)樣品，加入 10 mL蛋白質(zhì)提取液3 (0.1 mol/L Tris，0.5 mmol/L 甘氨酸)，水平振蕩30 min，12 000 r/min離心30 min后，取上清；上清液于100 ℃水浴鍋中加熱5 min，12 000 r/min離心30 min取上清。

酶解：取10 μL上清液，加入90 μL Rapigest SF(質(zhì)量濃度1 mg/mL)，按酶/蛋白質(zhì)質(zhì)量比為2∶5加入胰蛋白酶溶液(0.1 mg/mL)，加入水使酶解液體積達(dá)到198 μL，酶解12 h，加入2 μL甲酸終止酶解，12 000 r/min離心30 min后， 取上清；待LC-MS/MS上樣分析。

1.3.3 UPLC-Q-Exactive Focus MS條件

色譜條件色譜柱：EC-C18色譜柱(100 mm×3 mm， 1.7 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A：含1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：含1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，97%～70%A；15～18 min，70%～100%A；18～22 min， 0%A；22～22.1 min，0%～97%A；22.1～25 min，97%A；流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件:帶有加熱器的電子噴霧電離源(HESI)，輔助氣體加熱器溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V； 毛細(xì)管溫度為320 ℃；正模式的電噴霧電壓設(shè)置為3 500 V；掃描模式：Full MS+ddMS2正離子模式數(shù)據(jù)非依賴型掃描，其中Full MS的分辨率為70 000， 掃描范圍為400～1 400m/z，DD-MS2確認(rèn)模式分辨率17 500，四極桿的碰撞能量介于10～30 eV。

使用MaxQuent軟件[14]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，牙鲆PV的氨基酸序列用作Fasta文件。

1.3.4 LC-MS/MS方法的建立

色譜條件色譜柱：BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm， 2.7 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A：含1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：含1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～13 min，97%～70%A；13～18 min，70%～40% A；18～19 min， 40%～0% A；19～21 min， 0% A；21～22 min， 0%～97% A；22～24 min， 97% A。流速0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件離子源：電子噴霧電離源(ESI)；毛細(xì)管電壓：3 500 V；霧化氣壓力：275.9 kPa；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：12.0 L/min(氮?dú)?；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽段的選擇

重組PV酶解液經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，其數(shù)據(jù)經(jīng)MaxQuent軟件處理，從而得到酶解肽段的響應(yīng)及得分(表1)。

表1 重組PV的酶解肽段的響應(yīng)及得分Table 1 Intension and scorre of enzymolysis peptides of recombination PV

根據(jù)肽段穩(wěn)定性和質(zhì)譜檢測(cè)的要求，特征肽不應(yīng)含有易氧化氨基酸半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)且長(zhǎng)度在8到18個(gè)氨基酸[15]， LFLQNFSASAR、ALTDAETK、 SDFIEEDELK滿足要求，因此選擇這3個(gè)肽段作為特征肽段。CARRER等[6]將LFLQNFSASAR等19種作為鑒定真骨魚(yú)的肽段，沒(méi)有將ALTDAETK、 SDFIEEDELK作為鑒定真骨魚(yú)的肽段。為了確定肽段的獨(dú)特性，3個(gè)特征肽段在UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列對(duì)比，結(jié)果顯示SDFIEEDELK為牙鲆特有肽段，而LFLQNFSASAR和ALTDAETK兩個(gè)肽段在三文魚(yú)、鯉魚(yú)、鱈魚(yú)、鱸魚(yú)等多種真骨魚(yú)中含有。用LC-MS/MS方法對(duì)三文魚(yú)和鯉魚(yú)肌肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有SDFIEEDELK檢出，LFLQNFSASAR和ALTDAETK均有檢出，與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果一致。

2.2 前處理方法優(yōu)化

首先對(duì)提取液方法進(jìn)行優(yōu)化，以提取液所提取的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行比較分析；其次在重組PV的酶解方法(見(jiàn)1.3.1)基礎(chǔ)上對(duì)IAA濃度、酶用量、酶解時(shí)間4個(gè)酶解條件依次進(jìn)行單因素水平的優(yōu)化，以肽段在儀器上的相對(duì)響應(yīng)進(jìn)行比較分析。

2.2.1 蛋白質(zhì)提取液的優(yōu)化

在WU等[16]的牙鲆PV提取液1的基礎(chǔ)上進(jìn)行提取液的優(yōu)化，優(yōu)化的3種蛋白質(zhì)提取液分別為：蛋白質(zhì)提取液1：Tris(0.1 mol/L)，甘氨酸(0.5 mmol/L)，DTT(1 mmol/L)；蛋白質(zhì)提取液2：Tris(0.1 mol/L)，甘氨酸(0.5 mmol/L)，DTT(1 mmol/L)，EDTA(5 mmol/L)；蛋白質(zhì)提取液3：Tris(0.1 mol/L)，甘氨酸(0.5 mmol/L)。

提取液1、2、3所提取的總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為1.49 mg/mL、1.18 mg/mL、0.94 mg/mL(蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度由BCA方法測(cè)得)。由圖1可以看出，ALT、LFL兩個(gè)肽段的相對(duì)響應(yīng)為提取液3>提取液2>提取液1，對(duì)于SDF肽段來(lái)說(shuō)提取液3>提取液1>提取液2。

圖1 提取液優(yōu)化Fig.1 Optimization of extraction liquid

提取液中的DTT作為一種還原劑，可以避免蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，阻止蛋白高分子聚合物的形成提高提取效率[3]，但是在酶解過(guò)程中DTT也會(huì)對(duì)酶作用，抑制酶的活性導(dǎo)致酶解效率降低，從而質(zhì)譜響應(yīng)降低，因此經(jīng)不含DTT的提取液3提取的樣品響應(yīng)最高；從提取液1和提取液2比較來(lái)看，EDTA對(duì)蛋白提取效率沒(méi)有提高作用。綜合考慮選擇提取液3。

2.2.2 IAA濃度的優(yōu)化

進(jìn)行IAA(5 mmol/mL)用量的優(yōu)化，IAA優(yōu)化的3個(gè)水平分別為添加0、15、30 μL，其結(jié)果如圖2所示，對(duì)于ALT、SDF肽段來(lái)說(shuō)0 μL>15 μL>30 μL，對(duì)于LFL來(lái)說(shuō)30 μL>0 μL>15 μL。肽段與IAA烷基化過(guò)程中發(fā)生的非特異性化學(xué)修飾有關(guān)[18]，這將改變標(biāo)肽的質(zhì)量，而肽的質(zhì)量發(fā)生變化將導(dǎo)致該肽不能被MRM方法檢出，因此測(cè)得的肽產(chǎn)率將低于實(shí)際產(chǎn)率；再者作為烷基化試劑的IAA可能對(duì)酶存在一定的抑制作用從而導(dǎo)致酶解程度下降，綜合考慮，選擇酶解過(guò)程不添加IAA。

圖2 IAA優(yōu)化提取液優(yōu)化Fig.2 Optimization of IAA

2.2.3 酶用量?jī)?yōu)化

PV是一種鈣結(jié)合蛋白，具有由約30 個(gè)氨基酸殘基組成的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白模體的EF手圖像，每個(gè)EF手圖像(模體)結(jié)合1個(gè)Ca2+，為小清蛋白提供了更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[1]，PV具有較高的酶解穩(wěn)定性，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5個(gè)水平的酶/蛋白質(zhì)(質(zhì)量比)高于一般的酶/蛋白質(zhì)(1∶100～1∶10)[17]，酶/蛋白質(zhì)(質(zhì)量比)分別為1∶10、1∶5、2∶5、3∶5、4∶5(提取液蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA方法側(cè)得)。酶用量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖3所示，ALT與SDF肽段相對(duì)響應(yīng)隨酶/蛋白質(zhì)的增加而增強(qiáng)，但ALT肽段相對(duì)響應(yīng)變化較為緩慢，SDF變化較大，而LFL肽段相對(duì)響應(yīng)隨酶/蛋白質(zhì)(質(zhì)量比)增加大致呈降低趨勢(shì)。

圖3 酶/蛋白質(zhì)質(zhì)量比的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the ratio of enzyme and protein

不同的肽段由于其所在二級(jí)結(jié)構(gòu)、自身性質(zhì)及酶濃度不同，其酶解效率有所差異，酶/蛋白質(zhì)(質(zhì)量比)為1∶10～4∶5，ALT肽段的酶解得量比較穩(wěn)定，改變酶的濃度對(duì)酶解效果影響不大，可能已經(jīng)達(dá)到較高程度的酶解；SDF肽段的酶解得量隨酶/蛋白質(zhì)的增大而增大，說(shuō)明此肽段還未達(dá)到完全或較高程度的酶解；LFL肽段可能由于酶解產(chǎn)物抑制或酶錯(cuò)切造成其響應(yīng)隨酶濃度增加而逐漸降低，綜合考慮以酶解得量比較穩(wěn)定的ALT肽段作為定量肽段，以SDF、LFL肽段為定性肽段，酶/蛋白質(zhì)為2∶5。

2.2.4 酶解時(shí)間優(yōu)化

分別選擇4、6、8、10、12、14 h六個(gè)酶解時(shí)間進(jìn)行酶解時(shí)間的優(yōu)化，如圖4所示，ALT、SDF、LFL三個(gè)肽段酶解12 h后達(dá)到平臺(tái)期，因此酶解時(shí)間12 h為最優(yōu)，酶解時(shí)間優(yōu)化圖如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間優(yōu)化Fig.4 Optimization ofenzymolysis time

2.2.5 酶解效率

蛋白質(zhì)的定量依賴于該蛋白質(zhì)消化成的用作定量的目標(biāo)肽段，而對(duì)于蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量方法的準(zhǔn)確性取決于用作定量的目標(biāo)肽段的酶解程度，若該目標(biāo)肽段沒(méi)有達(dá)到完全酶解則會(huì)損害方法的準(zhǔn)確性[18]，以優(yōu)化的牙鲆樣品的最優(yōu)酶解條件(酶/蛋白質(zhì)為2∶5，酶解時(shí)間12 h)，對(duì)1 000 mg/mL、500 mg/L、200 mg/L 三個(gè)質(zhì)量濃度水平的重組PV進(jìn)行酶解，以ALT肽段作為定量肽段，以SDF與LFL肽段為定性肽段， ALT肽段酶解效率在104%～106%，滿足檢測(cè)要求。

2.3 LC-MS/MS方法質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

LFL定性離子對(duì)與CARRERA等[6]一致，其他肽段質(zhì)譜參數(shù)沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，為了獲得最佳的質(zhì)譜采集參數(shù)，對(duì)ALT、SDF、LFL、sdf四個(gè)合成肽段的前體離子、產(chǎn)物離子、碎裂電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 線性關(guān)系與定量限

以ALT肽段為定量肽段，SDF、LFL肽段為定性肽段，建立PV的檢測(cè)方法，在0.005～100 000 mg/L 9個(gè)點(diǎn)質(zhì)量濃度，ALT質(zhì)譜響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)sdf響應(yīng)之比(y)與ALT濃度與內(nèi)標(biāo)sdf濃度之比(x) 的線性關(guān)系為y= 1.221 1x+0.013 3(R2>0.999)。小清蛋白定量限為2.74 mg/kg。

表2 小清蛋白的酶解3個(gè)肽段的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass spectrometric parameters of three peptides

2.3.3 添加回收

大菱鲆與牙鲆是同屬于鲆科的真骨魚(yú)類，經(jīng)已經(jīng)建立的LC-MS/MS方法檢測(cè)，大菱鲆中不含SDFIEEDELK、LFLQNFSASAR和ALTDAETK肽段。為了驗(yàn)證牙鲆中PV含量檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，選擇與牙鲆相近的物種大菱鲆為空白基質(zhì)，以重組PV為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，3個(gè)添加水平的平均回收率在95%～102%，滿足檢測(cè)要求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3%～6%。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用大菱鲆為空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)牙鲆進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為ALT肽段含量為0.85 mg/g，小清蛋白含量為11.72 mg/g。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了以Tris(濃度0.1 mol/L)、甘氨酸(濃度0.5 mmol/L) 為提取液，酶解過(guò)程中酶/蛋白質(zhì)(質(zhì)量比)為2∶5，酶解時(shí)間為12 h的牙鲆中PV的前處理方法；以ALTDAETK為定量肽段，SDFIEEDELK、SDFIEEDELK為定性肽段的牙鲆PV的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，首次實(shí)現(xiàn)了用LC-MS/MS方法對(duì)牙鲆中主要過(guò)敏原PV的精確定量檢測(cè)。