MTBSTFA衍生化結合GC-MS分析鎮(zhèn)江香醋不揮發(fā)羧酸

李俊雯，范文來，徐巖

(江南大學 生物工程學院，教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)

鎮(zhèn)江香醋是中國四大名醋之一[1]，作為傳統(tǒng)酸性調味品在人們日常飲食生活中發(fā)揮著重要作用[2]。酸味是食醋最重要的味覺特征，而羧酸是影響食醋味覺和口感的重要因素，其中不揮發(fā)性有機酸和氨基酸能夠調和揮發(fā)酸乙酸刺激的酸味，賦予食醋輕柔的口感[3]。

國內外測定醋中不揮發(fā)羧酸的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、離子色譜法[5]、液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS)[6]法、核磁共振[7]等。目前應用HPLC和攪拌棒吸附萃取結合氣質聯(lián)用(SBSE-GC-MS)等方法在鎮(zhèn)江香醋中檢測到的不揮發(fā)酸有：乳酸、焦谷氨酸、草酸、酒石酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸[4]、蘋果酸、富馬酸[8]、馬來酸[9]、苯甲酸、苯乙酸和3-甲硫基丙酸[10]等10余種，應用氨基酸自動分析儀測得各類氨基酸20余種[11]。與HPLC或LC-MS相比，氣相色譜-質譜法(GC-MS)靈敏度和分辨率更高，檢測限更低[12]。當然，在GC-MS分析前，不揮發(fā)化合物須經衍生化處理，增強其揮發(fā)性。

在眾多衍生化方法中，硅烷衍生化是較為常用的一種手段，已經廣泛應用于白酒[13]、煙草[12]、酒醅[14]等多種基質和原料檢測中。常用的硅烷衍生化試劑有N-特丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide, MTBSTFA)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA)，對檢測沒有空間位阻的羧酸來說，使用MTBSTFA作衍生化試劑效果更佳[15]。

本研究以市售恒順鎮(zhèn)江香醋為研究對象，采用MTBSTFA硅烷化衍生結合GC-MS檢測不揮發(fā)羧酸，并進行定量分析，以期更深入地認識鎮(zhèn)江香醋中不揮發(fā)羧酸的種類組成和含量分布，為食醋的品質提升和工藝改進提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：江蘇省恒順醋業(yè)股份有限公司生產的恒順金梅鎮(zhèn)江香醋成品(優(yōu)級，總酸≥5.50 g/100 mL)，于2018年9月購買自當?shù)爻小?/p>

試劑：表1和表2中所有全定量羧酸及同位素有機酸(十六烷酸-d31、十八烷酸-d35、琥珀酸-2,2,3,3-d4)、 MTBSTFA(99.5%)、乙醇、乙腈(色譜級)，美國Sigma-Aldrich公司；NaH2PO4、H3PO4(AR級)，上海國藥公司。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5418冷凍離心機，德國eppendorf公司；N-EVAP111氮吹儀，美國Organomation公司；電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；GC6890M-MSD5975 GC-MS儀，美國Agilent公司；Waters UPLC H-Class超高相液相色譜儀，美國Waters公司；Millipore-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理與MTBSTFA衍生化

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣(流速1.0 mL/min)；不分流進樣；升溫程序：65 ℃保持2 min， 以6 ℃/min升溫至320 ℃，保持10 min。進樣量1.0 μL。

MS條件：EI電離源；電子能量70 eV；發(fā)射電流25 μA；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍35～650 amu。

1.3.3 化合物定性和定量

化合物鑒定：定性結果通過與NIST05a.L數(shù)據(jù)庫(Agilent Technologies Inc.)中標準質譜圖比對，并與羧酸標準品衍生后的質譜圖和保留時間對比確定。通過對C5～C30正構烷烴混合標樣進行相同條件GC-MS 分析計算保留指數(shù)[17]。

化合物定量：配制一定質量濃度羧酸標準品母液，進行梯度稀釋后經過與樣品一致的衍生化處理，采用選擇離子模式(SIM)定量，以標準品與內標物質量濃度(100.0 mg/L)之比為縱坐標，峰面積之比為橫坐標，繪制標準曲線。通過將樣品中化合物與內標的SIM模式下積分峰面積比代入標準曲線得到樣品中化合物含量。

1.3.4 去蛋白和衍生化方法回收率測定

在去蛋白之前，分別于100 μL原醋樣中加入終質量濃度為57.32、80.25、97.44 mg/L的琥珀酸-2,2,3,3-d4；然后按方法1.3.1去蛋白后，取上清液分別加入終質量濃度為20.33、50.05、79.77 mg/L的十八烷酸-d35，氮吹干后加內標十六烷酸-d31(終質量濃度100.0 mg/L)， MTBSTFA衍生化，接著GC-MS分析。方法回收率的計算見公式(1)：

(1)

式中：p表示方法回收率;c1為樣品中檢測出的同位素有機酸的濃度;c0為樣品中加入的同位素有機酸的濃度。

1.3.5 超高相液相色譜法(UPLC)定量乳酸

參照文獻[18]，用超純水將鎮(zhèn)江香醋稀釋50倍，取1.0 mL過0.22 μm針頭式有機濾頭后進行UPLC分析。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (i.d 2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)；流動相：20 mmol/L NaH2PO4溶液(磷酸調節(jié)pH至2.7)；檢測波長：210 nm； 柱溫：30 ℃，流速：0.25 mL/min，進樣1.0 μL。

標準曲線：用超純水配制初始質量濃度為5.40 g/L的乳酸標準儲備液，并進行梯度稀釋，以乳酸峰面積為橫坐標，質量濃度為縱坐標建立標準曲線。

2 結果與分析

鎮(zhèn)江香醋經衍生化后，共鑒定出含乳酸在內的61種不揮發(fā)羧酸，其中氨基酸17種、芳香酸13種、羥基酸11種、長鏈脂肪酸8種、二元及多元酸7種(不含羥基)、含硫有機酸1種、雜環(huán)酸2種、酮酸1種和1種不揮發(fā)酸酯，其中羥基酸含量最高，達16.01 g/L，其次是雜環(huán)酸和氨基酸，總含量在500 mg/L以上，二元及多元酸、芳香酸、酮酸，長鏈脂肪酸總含量次之，在100～ 400 mg/L，含硫有機酸及酯含量最低，小于25 mg/L。

與鎮(zhèn)江香醋早期研究結果[2-4, 8-11]相比，新檢測到的化合物有2-糠酸、乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-羥基己酸、2-甲基丁二酸、戊二酸、甘油酸、扁桃酸、2-羥基-3-苯丙酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、棕櫚油酸、丙三酸、2,6-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、dl-對羥基苯乳酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、阿魏酸、檸檬酸、芥子酸、沒食子酸、咖啡酸等24種。

2.1 香醋衍生化定量方法

醋中添加琥珀酸-2,2,3,3-d4的回收率為80.44%，表明去蛋白和衍生化方法的總回收率不是太高，但相較于傳統(tǒng)添加沉降劑K4Fe(CN)6·3H2O和ZnSO4·H2O 去蛋白方法的回收率(41.30%)已經有了較大的提升[10]；在氮吹衍生化前加入十八烷酸-d35的回收率為94.06%，說明衍生化方法的回收率高。2個回收率比較后發(fā)現(xiàn)去蛋白過程有機酸損失率較大，推測可能是由于去蛋白時某些有機酸被包裹于蛋白中或有機酸與蛋白質結合形成了結合態(tài)有機酸。

除乳酸含量過高采用UPLC方法定量外，其他化合物均采用衍生化的方法繪制標曲并定量。各羧酸標準曲線線性良好，線性相關系數(shù)R2均在0.983 8～0.999 9，回收率在82%～118%(表1和表2)，這些化合物回收率在十八烷酸-d35的回收率上下波動，說明衍生化方法適用于醋中羧酸的檢測。

2.2 不揮發(fā)羧酸鑒定和定量

在所有檢測到的化合物(表1和表2)中，乳酸(15.86 g/L)含量最高，其次是焦谷氨酸(580.9 mg/L)，含量排第三位的是琥珀酸(273.3 mg/L)，后兩種酸是國家標準GB/T18623—2011[19]中鎮(zhèn)江香醋的特征有機酸。

質量濃度高于50 mg/L的酸有：精氨酸(187.1 mg/L)、草酰乙酸(150.2 mg/L)、2-羥基-3-苯丙酸(122.3 mg/L)、草酸(97.46 mg/L)、纈氨酸(68.53 mg/L)、半胱氨酸(61.33 mg/L)、絲氨酸(57.76 mg/L)、脯氨酸(56.86 mg/L)。其余酸含量均低于35 mg/L，2,6-二 羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸含量最低，為20～308 μg/L，棕櫚油酸和沒食子酸含量低于定量限。

2.3 羥基酸類化合物

如表1所示，在鎮(zhèn)江香醋中共檢測到羥基酸11種，包括首次檢測到的乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-羥基己酸、3-羥基-3-甲基戊二酸(共6種)。羥基酸總質量濃度達16.01 g/L，其中乳酸質量濃度最高為15.86 g/L(文獻報道乳酸含量為9.53～34.28 g/L[4, 8])，3-羥基-3-甲基戊二酸(33.68 mg/L)和乙醇酸(31.48 mg/L)含量次之。

乳酸來源于產酸菌分解葡萄糖[20]，沒有香氣但呈柔和酸味，可以減輕揮發(fā)性醋酸的刺激性氣味和口感[21]。新發(fā)現(xiàn)的化合物乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸呈酸味，2-羥基-4-甲基戊酸除了呈酸味外還呈甜味[13]。

2.4 芳香酸類化合物

芳香酸是鎮(zhèn)江香醋中除氨基酸外種類最多的一類化合物，共檢測到13種(其中酚酸9種)，總含量193.4 mg/L。除苯甲酸、苯乙酸外，其余芳香酸均是首次檢測到。鑒定出的酚酸主要為對羥基苯甲酸類(如對羥基苯甲酸、沒食子酸、原兒茶酸)和對羥基肉桂酸類(如咖啡酸)，以及酚醚類酸阿魏酸、芥子酸等。這些酚酸和酚醚類化合物是呈澀味的化合物，多具有抗氧化活性，主要通過苯丙酸途徑產生[17, 22]。

在芳香酸中，2-羥基-3-苯丙酸(俗稱苯乳酸)含量最高，達122.3 mg/L，占芳香酸總含量的63.58%，是以前研究中沒有關注的芳香酸。該酸在白酒中曾檢測到，呈酸味和澀味，在水中味覺閾值為1 360 μmol/L[13]。

2.5 二元及多元酸

在鎮(zhèn)江香醋中檢測到的二元酸主要有草酸、馬來酸、琥珀酸、富馬酸、戊二酸和2-甲基丁二酸；多元酸是丙三酸。戊二酸、2-甲基丁二酸、丙三酸為首次檢測到。該類酸中，琥珀酸(273.3 mg/L)含量是最高的。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產物，其酸味閾值1 074 μmol/L，澀味閾值84.58 μmol/L[13]。

表1 鎮(zhèn)江香醋中不揮發(fā)有機酸標準曲線及含量Table 1 Standard curves and concentrations of nonvolatile organic acids in Zhenjiang aromatic vinegar

續(xù)表1

序號RI化合物m/z斜率截距R2n回收率/%有機酸質量濃度a/(mg·L-1)二元及多元酸131 567草酸(oxalic acid)-2TBDMS2611.387 70.432 40.998 3119197.46±0.05211 744馬來酸(maleic acid)-2TBDMS2874.512 3-0.005 50.998 271141.747±0.09221 757琥珀酸(succinic acid)-2TBDMS2891.666 8-0.005 50.999 81195273.3±3.60241 7662-甲基丁二酸(2-methylsuccinic acid)-2TBDMS3036.348 5-0.036 80.993 8111156.004±0.03251 786富馬酸(fumaric acid)-2TBDMS2872.717 70.000 80.999 2111184.545±0.15261 854戊二酸(glutaric acid)-2TBDMS3030.972 5-0.004 10.996 811940.939 1±0.06442 374丙三酸(tricarballylic acid)-3TBDMS4611.049 80.006 90.995 58951.019±0.13芳香酸41 453苯甲酸(benzoic acid)-TBDMS1792.788 9-0.023 90.983 888816.48±0.0191 526苯乙酸(phenylacetic acid)-TBDMS1931.806 7-0.000 20.999 3119911.66±0.02281 894扁桃酸(mandelic acid)-2TBDMS2212.256 80.007 90.996 911852.158±0.00332 0372-羥基-3-苯丙酸(2-hydroxy-3-phenylpropionic acid)-2TBDMS3371.679 20.002 00.999 711110123.0±6.51362 102對羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid)-2TBDMS3230.822 80.001 80.996 711896.539±0.02382 112對羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)-2TBDMS3090.711 40.002 20.997 7118919.12±0.52462 4002,6-二羥基苯甲酸(2,6-dihydroxybenzoic acid b)-3TBDMSc4390.277 9-0.003 30.992710621.37±5.33512 530原兒茶酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)-3TBDMS4390.645 0-0.000 20.993 57840.926 2±0.02542 595dl-對羥基-苯基乳酸(dl-p-hydroxy-phenyl lactic acid)-3TBDMS1471.796 80.010 70.996 711859.458±0.05562 611阿魏酸(ferulic acid)-2TBDMS3651.537 8-0.015 90.991 071103.757±0.09582 760芥子酸(mustard acid)-2TBDMSc3952.497 2-0.000 30.999 08104308.8±5.58592 819沒食子酸(gallic acid)-4TBDMS5690.557 9-0.008 60.992 97-

注：a：數(shù)值為3次測量的平均值(即n=3)；b：采用UPLC法定量，濃度單位為g/L；c：濃度單位為μg/L；

2.6 長鏈脂肪酸

鎮(zhèn)江香醋中首次檢測到長鏈脂肪酸8種，包括5種飽和脂肪酸和3種不飽和脂肪酸，總含量105.0 mg/L，其中十六烷酸、十八烷酸和亞油酸含量較高。這些長鏈脂肪酸多呈油脂口感[23]，可能來源于釀造過程中脂肪的分解。

2.7 其他酸

醋中檢測出2種雜環(huán)酸，一種是常見的焦谷氨酸(580.9 mg/L)，另一種為首次檢測到的2-糠酸(16.38 mg/L)。 焦谷氨酸呈酸味，閾值30 mg/L[4]，含量遠高于閾值，說明其對鎮(zhèn)江香醋的酸味有一定的貢獻。

另發(fā)現(xiàn)一種含硫有機酸，3-甲硫基丙酸(7.569 mg/L)，該物質曾通過SBSE-GC-MS方法檢測到過[10]。

新檢測到一種酮酸即草酰乙酸(150.2 mg/L)，為三羧酸循環(huán)中間產物，可通過轉氨基作用偶聯(lián)尿素循環(huán)轉化為天冬氨酸、丙酮酸和丙氨酸[24]。

2.8 氨基酸

在鎮(zhèn)江香醋中共鑒定出17種氨基酸(如表2)，總含量達546.5 mg/L，8種人體必需氨基酸除色氨酸未檢測到以外，其余7種都能通過MTBSTFA衍生化方法檢測到，總含量119.1 mg/L，占整個氨基酸含量的21.80%。

表2 鎮(zhèn)江香醋中氨基酸標準曲線及含量Table 2 Standard curves and concentations of amino acids in Zhenjiang aromatic vinegar

3 結論

在鎮(zhèn)江香醋中檢測到61種不揮發(fā)化合物，包括17種氨基酸、13種芳香酸、11種羥基酸、8種長鏈脂肪酸、7種二元及多元酸(不含羥基)、1種含硫有機酸、1種酮酸，2種雜環(huán)酸，還有1種不揮發(fā)酸酯，其中新檢測到如2-糠酸、乙醇酸、3-羥基丙酸、甘油酸、扁桃酸、對羥基苯乙酸、2,6-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、阿魏酸、檸檬酸、芥子酸、沒食子酸、咖啡酸等24種不揮發(fā)性有機酸。采用MTBSTFA衍生化定量方法的回收率82%～118%，符合定量要求。研究發(fā)現(xiàn)羥基酸含量最高，其次是雜環(huán)酸和氨基酸。單個酸中，含量從高到低依次為乳酸、焦谷氨酸、琥珀酸、精氨酸、草酰乙酸和2-羥基-3-苯丙酸(含量大于100 mg/L)。豐富的有機酸和氨基酸構成了鎮(zhèn)江香醋的獨特風格，后續(xù)應側重單個以及群體羧基酸對鎮(zhèn)江香醋口感貢獻的研究，為香醋品質提升奠定基礎。