高取代度磷酸魔芋葡甘聚糖酯的制備

劉丹, 鄧利玲,2,鄭連姬,3, 鐘耕*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市生物技術研究所有限責任公司，重慶，401121) 3(重慶市食品工業(yè)研究所，重慶，400020)

目前國內外主要以NaH2PO4與Na2HPO4為酯化劑對多糖進行酯化改性，引入了磷酸基團，可改善其結構和理化性質[4]。其主要采用濕法、干法、擠壓法。磷酸魔芋葡甘聚糖酯(konjac glucomannan phosphate ester, KGMP)的生產主要以濕法為主，此法操作簡便，反應條件溫和，但取代度(degree of substitution, DS)不高，均低于0.06，且需使用大量昂貴的有機溶劑，受KGM水溶性的限制，對酯化反應的規(guī)律性缺乏探討[5-6]；干法改性成本低，取代度高(0.08～0.17)， 但反應不均勻，易產生其他副產物，工業(yè)生產時對設備要求較高[7-8]；擠壓法由于過高的壓力和過度的剪切使KGM黏度降得很低，不能滿足應用要求。半干法反應相中水分含量在20%～40%，具有節(jié)能、降耗、高效、無廢水排放等特點[9]。與傳統(tǒng)的加熱方式相比，微波具有加熱速度快、加熱時間短、加熱均勻等優(yōu)點，已作為新型能源廣泛用于化學改性中[10-11]。此外，杜先鋒等[12]研究表明在一定真空度下，物料內水分擴散速度加快，水分的擴散有利于化學反應的進行。ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)真空處理技術形成的內外壓差使得淀粉顆粒變得疏松，有利于氧化劑與淀粉充分混合。然而，真空輔助微波半干法用于KGMP的制備，目前國內外尚未見文獻報道。

本試驗根據(jù)前人的研究，從快速、節(jié)能、減排及降耗考慮，以KGM為原料，NaH2PO4與Na2HPO4混合鹽為酯化劑，采用真空輔助微波半干法制備KGMP，并通過響應面試驗優(yōu)化酯化條件，為環(huán)境友好制備高取代KGMP提供理論與實際應用的支撐，促進KGMP作為抗老化劑在冷凍食品中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋粉(符合NY/T494—2010中普通魔芋微粉標準)，重慶市康佳客有限公司；Na2HPO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；NaH2PO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；尿素(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZ600/2S 型真空包裝機，上海人民包裝股份有限公司；MAS-Ⅱ型微波快速制樣系統(tǒng)，上海新儀化學科技有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；YB-750A 型多功能粉碎機，浙江永康市速鋒工貿有限公司；NDJ-5S 型旋轉黏度計，上海越平儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Spectrum 100 紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魔芋葡甘聚糖磷酸酯(KGMP)真空輔助微波半干法制備方法

準確稱取一定質量的KGM，將NaH2PO4與Na2HPO4混合物(摩爾比2∶1)和尿素用質量分數(shù)為30%(以KGM用量計)的蒸餾水配制成磷酸鹽水溶液，用3 mol/L 的HCl和3 mol/L的NaOH調節(jié)到合適的pH值，將所述懸濁液在攪拌條件下噴入到KGM微粉中，混合均勻，制得半干混合物，放入聚乙烯袋中，用真空包裝機真空處理一段時間，然后將樣品倒入燒杯中，置于微波反應器中進行微波加熱，反應完畢后，將反應完畢的物料用體積分數(shù)為50%乙醇進行數(shù)次洗滌，再用70%、80%、100%的乙醇進行梯度洗脫，濾去洗液，將濾餅放入45 ℃的鼓風干燥箱中烘干過夜，干燥后的物料經粉碎過100目篩，即得到KGMP白色粉末。

1.3.2 取代度的測定

KGMP的取代度測定主要依據(jù)結合磷的含量[14]，結合磷的含量是由總磷減去游離磷的含量得到的。產物總磷含量采用GB5009.87—2016《食品安全國家標準食品中磷的測定》[15]方法進行測定，游離磷測定采用HCl溶解試樣，蒸餾水多次洗滌后，過濾后取濾液，進行鉬酸銨顯色反應。由圖1所示的標準磷曲線對應出試樣中磷含量，從而求得取代度(DS)，DS按公式(1)計算[6]：

(1)

圖1 磷含量標準曲線Fig.1 Criterion curve of phosphorus content

1.3.3 單因素試驗

本試驗主要考察微波反應時間、微波反應溫度、酯化劑與KGM摩爾比、真空處理時間、pH值、尿素用量對KGM取代度的影響，以方法1.3.1制備KGMP，以方法1.3.2測定其DS，以DS作為評價指標。

1.3.3.1 微波反應時間對取代度的影響

考察微波反應時間分別為5、6、7、8、9、10 min時，對樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質量分數(shù))、pH 5.0、真空處理時間30 s、反應溫度90 ℃。

1.3.3.2 微波反應溫度對取代度的影響

考察微波反應溫度分別為70、80、90、100、110 ℃時，對樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質量分數(shù))、pH 5.0、真空處理時間30 s、 反應時間7 min。

1.3.3.3 酯化劑用量對取代度的影響

考察酯化劑與KGM摩爾比為0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1時，對樣品取代度的影響。固定尿素用量6%(質量分數(shù))、pH 5.0、真空處理時間30 s、反應溫度90 ℃、 反應時間7 min。

1.3.3.4 真空處理時間對取代度的影響

考察真空處理時間分別為0、10、20、30、40 s時，對樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質量分數(shù))、pH 5.0、反應溫度90 4 ℃、反應時間7 min。

1.3.3.5 pH值對取代度的影響

考察pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0時，對樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質量分數(shù))、真空處理時間30 s、反應溫度90 ℃、反應時間7 min。

1.3.3.6 尿素用量對取代度的影響

考察尿素用量分別為0%、2%、4%、6%、8%時，對樣品取代度的影響。固定酯化劑與KGM摩爾比為0.7∶1、尿素用量6%(質量分數(shù))、pH 5.0、真空處理時間30 s、反應溫度90 ℃、反應時間7 min。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)中心組合試驗設計原理，通過單因素試驗對KGMP取代度影響的分析，固定微波功率300 W，微波時間7 min，尿素用量6%(質量分數(shù))。選取磷酸鹽用量、pH值、真空時間和微波反應溫度為自變量(X)，各分3個水平，以取代度為響應值(Y)，采用Design Expert 8.0軟件設計響應面試驗方案并對試驗結果進行回歸分析。試驗設計采用4因素3水平的響應面試驗(見表1)。

表1 響應面試驗設計因素水平取值Table 1 Coded levels of independent variables used in the RSM design

1.3.5 表觀黏度的測定

稱取1.0 g KGM和不同取代度的KGMP分散于99 mL蒸餾水中，在60 ℃水浴條件下溶脹1 h，冷卻至25 ℃，然后分別用NDJ-5型旋轉黏度計在25 ℃恒溫下測定溶液的表觀黏度。

1.3.6 透光率的測定

稱取一定質量的KGMP配成質量分數(shù)為1%的溶液，60 ℃水浴條件下溶脹，冷卻至室溫25 ℃。以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計進行全波長掃描其透光率。

1.3.7 傅里葉紅外光譜的測定

采用KBr壓片法，以空氣作為對照，掃描波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描累加32次。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上試驗無特殊說明，均重復3次，結果取平均值。采用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Origin 8.0 軟件制圖，Design Expert 8.0軟件進行響應面試驗及結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波反應時間對取代度的影響

微波反應時間對取代度的影響如圖2所示，隨著微波反應時間的延長，產物的取代度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。反應時間越長，反應物之間的碰撞幾率增加，酯化劑能夠充分地與KGM表面的羥基進行反應；當微波時間為7 min時，取代度達到最大值，反應7 min之后，取代度不斷降低，原因是KGM表面可及的羥基已經與磷酸根發(fā)生了反應，而過多的酯化劑無法接觸到活性羥基，并且長時間高溫反應使得KGM發(fā)生了熱降解或其他副反應，從而導致取代度的降低，且產品出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象[16]。因此，微波反應最佳時間為7 min。

圖2 微波反應時間對DS的影響Fig.2 Effect of microwave reaction time on DS

2.1.2 微波反應溫度對取代度的影響

如圖3所示，微波反應溫度對取代度的影響較大，隨著微波反應溫度的增加，產物的取代度先增加后降低。反應溫度升高會促使KGM分子間的氫鍵斷裂，從而酯化劑與KGM分子的羥基充分接觸，有利于親核酯化反應的進行；此外，溫度的升高會使分子運動速率加快，使磷酸鹽試劑與分子的碰撞幾率增加，有利于磷酸基團與羥基的結合，故取代度也相應地增加[7]。反應溫度在100 ℃以上，取代度降低，原因是溫度過高焦化嚴重，影響取代效率和產品質量。所以微波反應最佳溫度為100 ℃。

圖3 微波反應溫度對DS的影響Fig.3 Effect of microwave reaction temperature on DS

2.1.3 酯化劑用量對取代度的影響

如圖4所示，磷酸鹽用量對取代度的影響很大。當磷酸鹽與KGM的摩爾比低于0.7∶1時，加大磷酸鹽的用量，產物的取代度顯著增加。當磷酸鹽與KGM的摩爾比高于0.7∶1時，磷酸鹽再增加，取代度的增加變得十分緩慢。這是因為KGM分子上活性羥基基團數(shù)目有限，低劑量的酯化劑范圍內，取代度受磷酸鹽含量控制，高劑量范圍KGM酯化反應所需的磷酸鹽以及達到飽和，磷酸鹽與KGM的摩爾比高于1∶1后，取代度并不會有較大的提高，只會增加產物中游離磷含量，導致產品顏色發(fā)黃，給后面的洗滌工序帶來困難[17]。故磷酸鹽與KGM摩爾比為0.7∶1為宜。

圖4 磷酸鹽與KGM的摩爾比對DS的影響Fig.4 Effect of molar ratio of phosphate and KGM on DS

2.1.4 真空處理時間對取代度的影響

如圖5所示，真空處理時間對取代度的影響較大。未真空處理時KGMP的取代度為0.138；當真空處理10 s時，取代度顯著增加，為0.163；且隨著處理時間增加，取代度呈現(xiàn)增加的趨勢。這可能是因為在一定的真空度下處理KGM，產生的內外壓差可使KGM顆粒結構蓬松，KGM分子上的-OH充分暴露出來；另一方面，內外壓差還會促使反應相中反應物彼此混合均勻，提高KGM酯化反應效率[13]。真空處理時間太長使混合物結塊，在微波加熱時易產生焦糊現(xiàn)象，故真空處理時間為30 s為宜。

圖5 真空處理時間對DS的影響Fig.5 Effect of vacuum treatment time on DS

2.1.5 pH值對取代度的影響

酯化反應的過程中，適量的氫離子能夠促進酯化反應，pH低于3.0時，KGM會出現(xiàn)碳化的現(xiàn)象[18]。此外，pH在4.0～5.0，磷酸鹽的溶解度為20%～36%，當pH大于6.0時，磷酸鹽的溶解度為13%[19]。故選取對pH值3.5～6.0進行單因素試驗。如圖6所示，隨著pH值的增加，取代度先增加后降低。當pH值較低時，KGM適度降解，暴露出更多的活性羥基基團，且分子間相互作用力減弱，有利于酯化反應；當pH值大于5.0后，磷酸鹽的溶解度降低，且其存在形式發(fā)生變化，導致DS下降。故pH值為5.0左右最佳。

圖6 pH值對DS的影響Fig.6 Effect of pH value on DS

2.1.6 尿素含量對取代度的影響

尿素作為催化劑，能夠促進KGM分子中的葡萄糖、甘露糖殘基打開氫鍵，游離出羥基，加快酯化反應速度[6,20]。如圖7所示，隨著尿素含量的增加，取代度隨之增加，當尿素含量達到6%(質量分數(shù))后，尿素自身與KGM發(fā)生反應，從而與磷酸鹽之間競爭羥基，取代度不再增加。因此尿素含量為6%(質量分數(shù))為宜。

圖7 尿素含量對DS的影響Fig.7 Effect of urea content on DS

2.2 響應面優(yōu)化結果

按照中心組合試驗設計，設定不同A：正磷酸鹽與魔芋葡甘聚糖的摩爾比、B：pH值、C：真空處理時間、D：微波溫度。試驗結果見表2。多元回歸擬合所得取代度(DS)的二次多項回歸方程為公式(2)：

DS=0.20+0.000 333 3A-0.007 333B+0.001 333C-0.000 5D-0.026AB-0.004 75AC+0.006 75AD+0.023BC+0.001BD-0.005 75CD-0.012A2-0.053B2-0.013C2-0.014D2

(2)

表2 基于4因素3水平的響應面分析中心組合設計實驗結果Table 2 Central composite design, experimental data for three-level-four-factor response surface analysis

續(xù)表2

序號n(磷酸鹽)∶n(KGM)pH值真空時間/s微波溫度/℃DS90.6∶15.030900.176100.8∶15.030900.163110.6∶15.0301100.169120.8∶15.0301100.183130.7∶14.5201000.161140.7∶15.5201000.100150.7∶14.5401000.120160.7∶15.5401000.151170.6∶15.0201000.171180.8∶15.0201000.180190.6∶15.0401000.181200.8∶15.0401000.171210.7∶14.530900.144220.7∶15.530900.130230.7∶14.5301100.134240.7∶15.5301100.124250.7∶15.0301000.195260.7∶15.0301000.202270.7∶15.0301000.208280.7∶15.0301000.193290.7∶15.0301000.205

由表3可以看出，模型的F值<0.000 1，是極顯著的，而失擬項P=0.878 2 >0.05，模型失擬度不顯著。這說明該數(shù)學模型的建立是高度顯著的，具有合理性。即可利用此回歸方程確定制備高取代的KGMP的最佳工藝。

通過軟件分析確定制備KGMP的最佳工藝，即磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、pH值4.93、真空處理時間28.65 s、微波溫度100.55 ℃，此條件下由公式算出的KGMP取代度理論值為0.201。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進行3組驗證試驗，驗證試驗條件為磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、pH值5.0、真空處理時間29 s、微波溫度100 ℃，KGMP的DS為0.199，測定結果穩(wěn)定，標準偏差不大，證明該結果合理可靠。

2.3 表觀黏度

圖8顯示，未改性的KGM黏度達到39 417 mPa·s，而改性后KGMP黏度均有所下降，且隨著取代度的增加，黏度逐漸降低，當取代度為0.199時，KGMP的黏度下降到11 516 mPa·s。這是由于在反應過程中，酸和高溫的作用下，使得KGM分子鏈發(fā)生部分斷裂，降低其分子質量。與SITOHY等[21]在制備磷酸酯淀粉時結果類似。

表3 方差分析及相關統(tǒng)計參數(shù)結果Table 3 Result of analysis of variance (ANOVA) for quadratic model using DS as response

注：**為差異極顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

圖8 不同取代度KGMP的黏度Fig.8 Viscosity of KGMP with different substitution degrees

2.4 透光率

如圖9所示，在200～800 nm，與KGM相比，KGMP的透光率增加；隨著取代度的增加，KGMP的透光率增加。這是因為帶負電荷的磷酸基團引起的相鄰KGMP分子之間產生排斥作用，降低鏈間締合，增加了水與KGMP相互作用，形成具有高透光率的膠液[22]。

圖9 不同取代度KGMP的透光率Fig.9 Transmittance of KGMP with different substitution degrees

2.5 傅里葉紅外光譜分析

圖10 KGM和KGMP的紅外光譜圖Fig.10 FTIR patterns of KGM and KGMP

3 結論

以NaH2PO4與Na2HPO4混合鹽為酯化劑對KGM進行改性，通過真空輔助微波半干法獲得了高取代度KGMP。短時真空處理能夠顯著提高產品的DS；微波加熱速度快、加熱時間短、加熱均勻，反應只需7 min就能制備高取代度的KGMP。真空輔助微波半干法制備KGMP減少了酯化劑流失，同時縮短反應時間，能夠達到高效、節(jié)能、減排、降耗的效果。

真空輔助微波半干改性的最佳工藝條件:微波時間7 min、微波溫度100 ℃、磷酸鹽與KGM摩爾比為0.72∶1、真空處理時間29 s、pH值5.0、尿素用量6%(質量分數(shù))，在此條件下KGMP的取代度為0.199。隨著取代度的增加，KGMP的表觀黏度降低，透光率增加。紅外光譜表明KGM分子上成功引入磷酸基團。