微波皂化法提取桔皮中類胡蘿卜素及其組分分析

方明，孫志高，于奉生，張群琳，李甜，盛冉，郝靜梅

(西南大學柑桔研究所，重慶，400712)

類胡蘿卜素是一類由異戊二烯單元組成碳骨架的脂溶性色素，根據結構中是否含有氧官能團分為碳氫胡蘿卜素(carotene)和含氧衍生物葉黃素(xanthophyll)[1]。人體自身不能主動合成類胡蘿卜素，而柑桔卻富含豐富的類胡蘿卜素。研究者在柑桔中鑒定出超過115種類胡蘿卜素，且果皮中類胡蘿卜素的組成及含量遠超果汁[3]。目前，關于柑桔類胡蘿卜素的研究對象主要集中在果汁中[4]，而果皮類胡蘿卜素的研究報道較少。隨著人們對天然營養成分的需求呈指數級增長[5]，開發柑桔副產品作為天然類胡蘿卜素的來源并將其應用于食品中極具研究前景。

單羥基或二羥基化類胡蘿卜素即含氧衍生物葉黃素(xanthophyll)通常以更穩定的酯化形式存在于植物中，皂化是類胡蘿卜素提取純化而釋放游離類胡蘿卜素，除去葉綠素、脂肪等雜質的有效手段。據研究傳統冷皂化法時間長、對活性物質影響大；熱皂化法耗時雖短，但高溫易引起類胡蘿卜素降解。目前微波輔助法廣泛應用于食品中酯類的水解反應，它具有耗時短、效率高、回收率高、安全無污染等優點。微波輻射不同于傳統的由表及里加熱方式，是通過電磁波與反應物中存在的分子(特別是偶極子或離子分子)的直接耦合產生有效的“內部加熱”，實現能量的瞬時轉移，這種“內加熱作用”加熱速度快且均勻、無溫度梯度、無滯后效應，加快了化學反應并提高反應均勻性；除此之外，微波輻射的非熱效應如分子移動性和場穩定性，也可能有助于增強化學反應[6]。LIU等[7]研究證實微波能快速水解葉黃素酯，且很少產生葉黃素異構體。因此，本實驗以南豐蜜桔皮粉作為原料，在單因素實驗基礎上，采用響應面法對微波皂化的主要工藝參數進行優化，并研究不同皂化方式(冷皂化、熱皂化、微波皂化)對類胡蘿卜素組成及含量的影響，旨在提供一套高效的桔皮類胡蘿卜素皂化工藝且明確南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素的種類，以期為南豐蜜桔桔皮副產物綜合利用和天然類胡蘿卜素的開發提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南豐蜜桔皮，由中國農業科學院柑桔研究所提供。

無水乙醇(AR)、乙醚(AR)、KOH(AR)、丙酮(AR)、NaCl(AR)，重慶川東化工有限公司；甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、二氯甲烷(HPLC)、β-隱黃素(純度≥99.0%)，美國Sigma公司；葉黃素、玉米黃素、β-胡蘿卜素(純度均≥96.0%)，上海源葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HWC-3LA型微波提取設備，天水華圓制藥設備科技有限責任公司；雙光束紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；高效液相色譜Ultimate3000，戴安有限公司；LCMS-8030三重四級桿質譜儀(HPLC-DAD-APCI-MS，Shimadzu UFLCXR系統，配備光電二極管陣列檢測器SPD-M20A)；6202型高速粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司；恒溫水浴鍋，上海雙舜實業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桔皮類胡蘿卜素皂化提取物的制備

參考黃巧娟[8]的方法并稍作改動。將新鮮南豐蜜桔皮在40 ℃烘干至水分含量降至10%左右，粉碎、過200目篩，置于-18 ℃冷藏備用。取桔皮粉40 g，加入400 mL無水乙醇,在40 ℃水浴浸提3 h,重復浸提兩次，合并提取液并抽濾，將濾液真空濃縮至干，用乙醚復溶、離心后取上清液即桔皮總酯萃取物；將總酯萃取物、KOH-乙醇溶液加入25 mL棕色具塞試管中，震蕩搖勻并密封，經皂化處理后將皂化液倒入250 mL分液漏斗中，依次加入8 mL乙醚，8 mL 5 g/L的NaCl水溶液分層，用8 mL乙醚萃取下相2次，用0.5% NaCl水溶液水洗乙醚上相至中性，收集有機層濃縮得類胡蘿卜素皂化提取物。

1.3.2 微波皂化法工藝優化

1.3.2.1 單因素實驗

取4 mL桔皮總酯萃取物為原料，以類胡蘿卜素得率為指標進行單因素實驗，分別研究微波功率(200、300、400、500、600、700 W)、皂化時間(6、8、10、12、14、16 min)、KOH-乙醇溶液濃度(0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0 mol/L)、KOH-乙醇溶液添加量(1、2、4、6、8、10 mL)對類胡蘿卜素得率的影響。

1.3.2.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，選取對總類胡蘿卜素得率影響明顯的3個因素(微波功率、皂化時間、KOH-乙醇溶液濃度)，采用Box-Benhnken中心組合試驗設計對微波皂化類胡蘿卜素工藝條件進行響應面優化，確定最佳工藝參數。試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素及水平Table 1 The factor and levels of response surface optimization experiment

1.3.2.3 紫外-可見分光光度法測定總類胡蘿卜素

將桔皮類胡蘿卜素皂化提取物用丙酮復溶至10 mL， 在454 nm處測定吸光度值。同法制備β-胡蘿卜素標準溶液，繪制質量濃度和吸光值的標準曲線為y=0.141 9x+0.013 7(R2=0.999 1)，并由此計算類胡蘿卜素總量，類胡蘿卜素得率計算公式如式(1)：

(1)

式中：m，樣品中總類胡蘿卜素的質量，g；M，桔皮粉質量，g。

1.3.3 微波皂化法與傳統皂化法的對比

取總酯萃取物4 mL、2.0 mol/L的KOH-乙醇溶液4 mL進行皂化反應。3種皂化方式參數如下：微波皂化(500 W，12 min)、熱皂化(60 ℃，30 min)、冷皂化(25 ℃，12 h)，將類胡蘿卜素皂化提取物用V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶1混合液定容至2.0 mL，過0.22 μm濾膜后用HPLC測定，對比3種皂化方法后類胡蘿卜素組成和含量的變化。

1.3.4 C30-HPLC-DAD-APCI-MS法測定類胡蘿卜素

1.3.4.1 C30-HPLC-DAD-APCI-MS條件

HPLC：色譜柱為YMC -C30(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色譜柱；柱溫：40 ℃；檢測器SPD-M20A，波長450 nm，紫外-可見光譜掃描范圍250～600 nm；進樣量為10 μL，流動相為V(甲醇(A))∶V(乙腈(B))=8∶2，A、B均含有0.1%BHT。

MS：APCI源，離子源溫度450 ℃；干燥氣(氮氣)流速5.0 L/min；霧化氣(氮氣)流速4.0 L/min；CDL溫度：300 ℃；加熱板溫度：300 ℃；質譜儀全程采用正離子全掃描模式，m/z掃描范圍為350 ～1 200。

1.3.4.2 類胡蘿卜素的定性定量分析

葉黃素、玉米黃素、β-隱黃素、β-胡蘿卜素利用與標準品的保留時間的一致性進行鑒定，其余類胡蘿卜素組分將其紫外-可見光譜特征和質譜特征(質荷比m/z)與文獻中報道的數據進行比較，對類胡蘿卜素進行鑒定。

葉黃素、玉米黃素、β-隱黃素、β-胡蘿卜素通過相應標準品的標準曲線進行計算；無標品的類胡蘿卜素組分根據文獻報道的替換計算方法進行定量[9]，葉黃素之前洗脫的類胡蘿卜素組分和葉黃素異構體采用葉黃素標準曲線進行計算，zeinoxanthin和β-隱黃素環氧化物、順式β-隱黃素采用β-隱黃素標準曲線進行計算，八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ξ-胡蘿卜素采用β-胡蘿卜素標準曲線進行定量。總類胡蘿卜素含量即為分離的類胡蘿卜素含量之和。

1.3.5 數據處理

試驗數據以平均值±標準差的形式給出，采用SPSS 20.0.0 軟件進行方差分析和顯著性檢驗；利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行試驗設計和多元線性回歸分析程序擬合回歸曲線；用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 微波皂化的工藝優化

2.1.1 單因素實驗結果

2.1.1.1 微波功率對桔皮類胡蘿卜素得率的影響

微波處理時，高頻波使反應體系中含有的極性分子產生極化,并在交變電磁場作用下急劇運動而相互摩擦產生熱量，加速化學反應；同時由于鍵的振動、撕裂和粒子之間的相互摩擦、碰撞，促進分子活性部分更好地接觸和反應[10]。微波功率對類胡蘿卜素得率的影響如圖1-a所示，在皂化時間15 min、KOH-乙醇溶液濃度2.0 mol/L、KOH-乙醇溶液添加量2 mL的條件下，當微波功率為200～500 W時，隨著微波功率的增大皂化反應速率不斷加快，類胡蘿卜得率顯著上升，直至微波功率為500 W時，類胡蘿卜素得率達到了0.635 0‰。當微波功率達到600 W時，類胡蘿卜素得率迅速下降，產生這一現象的原因可能是由于過高的微波功率產生的瞬時高溫使密封體系在很短時間內產生很大壓強，影響體系密封性，從而使有機溶劑揮發導致萃取率下降；另一方面，由于類胡蘿卜素的熱不穩定性，而高溫可能導致降解等副反應發生，使得類胡蘿卜素得率下降。陳佩等[11]在微波提取胡蘿卜素汁中類胡蘿卜素的研究中，微波功率對類胡蘿卜素提取率的影響與本結果相似。因此，選取類胡蘿卜酯皂化的最佳微波功率為500 W。

2.1.1.2 皂化時間對類胡蘿卜素得率的影響

由圖1-b可知，在微波功率500 W、KOH-乙醇溶液濃度2.0 mol/L、KOH-乙醇溶液添加量2 mL的條件下，皂化時間對類胡蘿卜素得率影響顯著。皂化6 min時，微波輻射時間短，反應體系獲得的能量不足，類胡蘿卜素皂化不完全，其類胡蘿卜素得率僅為0.455 0‰。皂化6 min之后，類胡蘿卜素得率呈現上升的趨勢，在此期間，隨著類胡蘿卜素酯與KOH-乙醇溶液在微波場中不斷相互作用，類胡蘿卜素酯的脂肪酸基團不斷被羥基所取代，游離類胡蘿卜素不斷生成，類胡蘿卜素得率在12 min達到0.718 5‰。微波皂化12 min后，隨著皂化時間的延長，類胡蘿卜素得率開始下降。實驗表明微波皂化時間過長，類胡蘿卜素皂化過度，持續增加的熱能提供的高溫環境導致類胡蘿卜素發生降解，類胡蘿卜素得率有所降低。綜合考慮經濟效益和類胡蘿卜素得率，皂化時間12 min最佳。

2.1.1.3 KOH-乙醇溶液濃度對類胡蘿卜素得率的影響

KOH-乙醇溶液濃度對類胡蘿卜素得率的影響如圖1-c所示。在微波功率500 W、皂化時間12 min、KOH-乙醇溶液添加量2 mL的條件下，當KOH-乙醇溶液濃度為0.5 mol/L時，因堿液濃度過低，故催化效果不明顯，類胡蘿卜素得率僅為0.547 1‰。提高KOH-乙醇溶液濃度至1.0 mol/L時，類胡蘿卜素得率達到0.682 0‰。此后當KOH-乙醇溶液濃度繼續加大，類胡蘿卜素得率則有所降低。過高的堿液濃度會增大皂化體系的pH值，部分不耐堿的類胡蘿卜素可能發生降解；同時堿液濃度過高，皂化體系易發生乳化現象，需增加水洗次數，導致類胡蘿卜素損失增大。胡玉琴等[12]研究辣椒類胡蘿卜素皂化工藝，結果顯示KOH-乙醇溶液的濃度高于20%時，類胡蘿卜素的含量呈下降趨勢，分析認為可能是高濃度的強堿導致游離類胡蘿卜素分解。綜合分析本實驗選取KOH-乙醇溶液濃度為1.0 mol/L。

2.1.1.4 KOH-乙醇溶液添加量對類胡蘿卜素得率的影響

微波加速反應原理主要主要歸于微波輻射對極性分子的選擇性加熱，KOH-乙醇溶液對打開類胡蘿卜素酯鍵有直接關系。由圖1-d可知，在微波功率500 W、皂化時間12 min、KOH-乙醇溶液濃度1.0 mol/L的條件下，隨著KOH-乙醇溶液添加量的增加，類胡蘿卜素酯和堿液的接觸面增大，提高了反應的傳質效率，類胡蘿卜素得率上升，當添加量為4 mL時，類胡蘿卜素得率為0.644 4‰。添加量超過4 mL時，類胡蘿卜素得率呈現下降的趨勢。這可能是由于堿液過量，類胡蘿卜素皂化過度并發生降解；此外也可能是分層階段過量堿液影響了類胡蘿卜素在乙醇-乙醚-水體系中乙醚相的分配，從而導致類胡蘿卜素回收量降低。因此，在本研究中選取KOH-乙醇溶液添加量為4 mL。

2.1.2 響應面實驗結果

響應面試驗設計與結果見表2，將所得的試驗數據進行二次回歸分析，得到以類胡蘿卜素得率為目標函數的二次回歸方程:Y=0.70+0.011A-0.024B+8.487E-003C+0.014AB+7.500E-004AC+8.975E -003BC-0.027A2-0.011B2-0.043C2。

圖1 不同因素對類胡蘿卜素得率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield of carotenoids

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

注：**表示差異極顯著，P<0.01。

圖3中的響應面和等高線的形狀反映了微波功率(A)、皂化時間(B)、KOH-乙醇溶液濃度(C)對類胡蘿卜素得率的影響。由圖2-a可知，根據響應面在皂化時間和微波功率兩因素下曲面的陡峭程度，可見兩因素交互作用中皂化時間占主導作用，且等高線呈現明顯的橢圓形，表明兩因素交互作用顯著。同理由圖2-b可知，微波功率和KOH-乙醇溶液濃度兩因素交互作用中微波功率占主導作用，但兩因素交互作用不顯著。同理由圖2-c可知，皂化時間和KOH-乙醇溶液濃度兩因素交互作用中皂化時間占主導作用，且兩因素交互作用顯著。以上結果與方差分析結果一致。利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得出微波皂化法提取類胡蘿卜素的最佳工藝為：微波功率494.46 W、皂化時間為10 min、KOH-乙醇溶液濃度為1.0 mol/L，在此條件下模型預測類胡蘿卜素得率為0.711 2‰。為便于操作，將最佳條件調整為：微波功率為495 W、皂化時間為10 min、KOH-乙醇溶液濃度為1.0 mol/L，在此條件下進行3次平行實驗，所得類胡蘿卜素的平均得率為(0.709 6±0.11)‰，與理論預測值的相對誤差為0.5%，說明該模型給出的工藝參數可靠，可以為微波皂化法提取桔皮類胡蘿卜素的工藝優化提供理論指導。

圖2 各兩因素交互作用對類胡蘿卜素得率影響的曲面圖與等高線圖Fig.2 Surface and contour maps of the pariwise effects of interaction between two factors on carotenoid yield

2.2 南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素的鑒定

采用C30-HPLC-DAD-APCI-MS法對南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素組分進行分離和鑒定，桔皮中類胡蘿卜素的HPLC圖如圖3所示。

A-微波皂化；B-熱皂化；C-冷皂化圖3 南豐蜜桔皮類胡蘿卜素的HPLC圖Fig.3 HPLC diagram of carotenoids from Nanfeng mandarin peel

在本研究實驗的色譜條件下，C30色譜柱中共分離出27種類胡蘿卜素，將色譜、光譜、質譜信息的組合信息與研究者對水果類胡蘿卜素鑒定的詳細描述進行比對[13-17]，鑒定出了23種主要的類胡蘿卜素組分，其色譜、光譜、質譜特征如表4所示。不足的是仍然有4種類胡蘿卜素組分由于含量太低或存在共洗脫現象(特別是環氧類胡蘿卜素)，無法獲得完整、準確的光譜信息和質譜特征，故未能進行鑒定，4種未鑒定的類胡蘿卜素組分標記為未鑒定組分a、b、c、d。迄今未見文獻報道南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素組分鑒定的詳細信息，XUE等[18]用C30-HPLC-DAD法鑒定出南豐蜜桔皮中紫黃質、葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素4種類胡蘿卜素。本研究初步鑒定出南豐蜜桔中23種類胡蘿卜素，與柑桔果皮類胡蘿卜素的相關文獻報道有所不同[19-22]，未能檢測出β-檸烏素、β-citraurinene、α-隱黃素、α-胡蘿卜素和檸黃質，但檢測出zeinoxanthin，其在柑桔汁中多次報道[23]。與文獻報道不一致的地方可能是因為類胡蘿卜素在不同柑桔品種間的差異性，也有可能是提取溶劑和分析方法的差異性所導致。

2.3 不同皂化方式對桔皮類胡蘿卜素組成及含量的影響

3種皂化方式下桔皮類胡蘿卜素皂化提取物組成及含量見表4。由表4可知，3種皂化方式處理的桔皮類胡蘿卜素均主要以全反式形式存在，β-隱黃素、9-cis-紫黃質、黃體黃質、9-cis-花藥黃質、di-cis-新黃質、葉黃素、玉米黃素等是主要類胡蘿卜素組分，這與柑桔皮中類胡蘿卜素的研究一致[19-22]。3種皂化方式得到的相同類胡蘿卜素組分有23種，不同組分如zeinoxanthin在冷皂化樣品中未檢出，可能由于冷皂化時間長，zeinoxanthin大量降解；熱皂化后新生成的5,8-環氧-葉黃素，可能來源于高溫下葉黃素的環氧化反應，與KIMURA等[24]的研究結果一致。3種皂化方式中，總類胡蘿卜素含量微波皂化>冷皂化>熱皂化，微波皂化樣品總類胡蘿卜含量為590.49 μg/g，高出熱皂化37.15%，高出冷皂化3.63%。相較于胡蘿卜素(carotene)，含氧葉黃素(xanthophyll)對皂化方式更為敏感。CHEN等[25]研究不同皂化方式對不同植物材料類胡蘿卜素組分及含量的影響，結果也顯示熱皂化后葉黃素(xanthophyll)，特別是環氧類胡蘿卜素降解顯著。通過上述皂化方式對桔皮類胡蘿卜素的組成和含量的影響研究可得出，微波皂化法可作為一種有潛力的類胡蘿卜素快速皂化方法。

表4 南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素組分的鑒定及含量Table 4 Identification and content of carotenoids in Nanfeng mandarin peel

注：-:未檢出；Ⅲ/Ⅱ，光譜精細結構，類胡蘿卜素光譜中第三吸收峰與第二吸收峰的峰高之比，%;AB/AⅡ，順式峰強度，順式吸收峰吸光度之比。

3 結論

本研究以南豐蜜桔皮為原料，采用微波皂化法提取桔皮類胡蘿卜素并對其組成進行鑒定。研究了不同因素對類胡蘿卜素得率的影響，并選取微波功率、皂化時間、KOH-乙醇溶液濃度這3個影響較大的因素，利用響應面法對微波皂化法提取桔皮類胡蘿卜素工藝進行優化，考慮實驗的可行性及效應等綜合因素，確定的最佳工藝條件為：微波功率為500 W、皂化時間為10 min、KOH-乙醇溶液濃度為1.0 mol/L，其類胡蘿卜素得率為(0.709 6±0.11)‰，這一結果與陶俊[26]對南豐蜜桔皮類胡蘿卜素含量的報道基本吻合，且類胡蘿卜素得率顯著高于甄天元[27]、曾東慧等[28]和TAO等[29]研究者所獲得的類胡蘿卜素得率。利用C30-HPLC-DAD -MS所鑒定出的23種桔皮類胡蘿卜素組分與文獻報道基本吻合，并分析檢測了微波皂化、冷皂化、熱皂化3種皂化方式下南豐蜜桔皮中類胡蘿卜素的組成及含量，結果顯示3種皂化方式下類胡蘿卜素組分主要是以全反式形式存在，其中β-隱黃素、黃體黃質、9-cis-紫黃質、di-cis-新黃質、花藥黃質、葉黃素、玉米黃素等為主要類胡蘿卜素組分；微波皂化法獲得的類胡蘿卜素得率高于傳統熱皂化和冷皂化，能顯著縮短分析時間，且類胡蘿卜素在微波處理中表現出較高的穩定性，微波處理有效地抑制了皂化中類胡蘿卜素的降解、氧化等副反應，因此微波皂化法比傳統皂化法更有優勢，這與LIU等[7]研究的玉米黃素酯的微波皂化與傳統熱回流皂化對比的結果相似。

本研究結果顯示，微波皂化法提取桔皮類胡蘿卜素，更有利于加速皂化反應、提高類胡蘿卜素的得率，節能降耗，為類胡蘿卜素的提取提供了新思路，同時也為桔皮類胡蘿卜素的進一步利用提供了理論基礎。