黑曲霉SP7-2固態發酵產生淀粉糖化酶工藝優化

朱強，王瑞鑫，吳鋮迪，夏艷秋*

1 (江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港，222005) 2 (淮海工學院，江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室，江蘇 連云港，222005)

生料釀酒采用無蒸煮技術，可節約總能耗的30%～40%，是釀酒業實施節能降耗的重要舉措[1-2]，已引起人們的廣泛關注[3-7]，必將帶來釀酒業的顛覆性變革。生淀粉糖化酶(raw starch-digesting glucoamylase,RSGA)無疑是實現生料釀酒的先決條件也是關鍵技術[8-9]。現行的生淀粉糖化酶主要由微生物產生[9-26]，而適用于生料釀酒的生淀粉糖化酶源只有霉菌，目前已報道的主要有曲霉[16-21]、根霉[22-23]和青霉[24-26]，然而在其制曲工藝中，由于多采用恒溫培養，未遵循微生物生長代謝規律，未重視促酵劑的使用，對生產實際考慮不周等，導致制曲周期長、成曲酶活力低，嚴重阻礙其推廣應用。黑曲霉SP7-2為課題組通過自然分離結合誘變育種選育獲得的酒用生淀粉糖化酶優良菌株[20]，其生淀粉糖化酶活力高、復合酶系協同作用強，初步用于黃酒生料釀造顯示出一定的優越性，有望成為生料釀酒的重要生產菌株。試驗擬通過固態發酵技術探索黑曲霉SP7-2產酶優化工藝，并研究其放大生產性能，旨在為實現對生淀粉糖化酶產生菌生理特征和生料曲制備的深入研究，并進一步推動對現行生料釀酒工藝體系的技術升級和改造以提供試驗科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉(Aspergillus.niger)SP7-2：課題組選育，本研究室保藏。

麩皮：市售，當年新鮮小麥麩皮，水分12.3%(質量分數)，40～60目。

1.2 方法

1.2.1 種曲制備

麩皮∶水=1∶1.2(g∶mL)配料，添加適量營養鹽，拌勻，潤料2 h，121 ℃濕熱滅菌40 min，冷卻至30 ℃，按麩皮質量10%接種SP7-2單孢子懸浮液(懸浮液孢子密度1.0×108CFU/mL)，32 ℃培養3 d左右，38～40 ℃ 熱風烘干。

1.2.2 固態發酵基礎條件[20]

250 mL三角瓶裝10 g麩皮，料水比1∶1.2(g∶mL)，pH自然，拌勻，潤料，滅菌，冷卻，按麩皮質量0.3%接種SP7-2種曲(種曲孢子密度1×1010CFU/g)，180 r/min、32 ℃培養3 d，烘干。

1.2.3 生淀粉糖化酶活力測定[15]

發酵結束，三角瓶固體培養物中加入100 mL蒸餾水，40 ℃水浴振蕩浸提1 h，過濾得粗酶液。5 mL離心管中分別加入1 mL底物(用0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸緩沖液新鮮配制的質量分數為2%生玉米淀粉懸浮液)、1 mL適當稀釋的酶液，40 ℃、180 r/min水浴振蕩反應1 h，加入2 mol/L NaOH溶液0.1 mL終止反應，反應液5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定還原糖的量。定義：在上述分析條件下，1 min水解生淀粉產生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 工藝優化

試驗比較碳、氮源，水分，促酵劑(植酸)，pH值，溫度，通風等因素對SP7-2固態發酵產酶的影響，優化其產酶工藝條件。

1.2.5 放大試驗

30 L固態發酵罐，裝料系數65%，按照1.2.4優化工藝參數固態發酵，探討30L固態發酵罐中SP7-2生長繁殖與代謝產酶規律，確定發酵終點，并適當調整工藝參數。

2 結果與分析

2.1 最適培養基質的確定

表1表明，培養基質對SP7-2菌株生長繁殖及產酶的影響較大，其中，最適宜的固態發酵基質是麩皮，其次是大米和小麥。考慮到經濟因素，不宜采用大米和小麥。因此，后續試驗均采用麩皮為SP7-2菌株固態發酵產RSGA基質。

表1 培養基質對SP7-2固態發酵的影響Table 1 Effects of different matrixes on SP7-2 by SSF

2.2 最適料水比的確定

由表2可知，料水比對SP7-2菌株生長繁殖及產酶的影響是顯著的。在一定范圍內，隨料水比的增加，酶活力呈現先增加后降低的趨勢，而孢子數卻呈現遞增趨勢。當料水比較低時，營養菌絲生長慢且不發達，培養物中心含有明顯的未被消耗的淀粉顆粒，酶活力及孢子數均較低。而料水比過高時，由于營養菌絲前期生長快，使得培養物中心易積聚高溫，出現爛心和表面凝結水現象，從而促進氣生菌絲及分生孢子產生，導致酶活力急劇下降。因此，后續試驗SP7-2菌株固態發酵產RSGA料水比為1∶1.1(g∶mL)，制備種子料水比為1∶1.2(g∶mL)。

表2 料水比對SP7-2固態發酵的影響Table 2 Effects of different water cotents on SP7-2 by SSF

2.3 復配氮源的確定

由表3可以看出，復配氮源可提高SP7-2菌株RSGA的活力，且有機氮優于無機氮，豆餅粉優于蛋白胨。(NH4)2SO4作為復配氮源，孢子數得到較大提高。

表3 復配氮源對SP7-2固態發酵的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on SP7-2 by SSF

因此，SP7-2菌株固態發酵產RSGA時可適當配比20%～30%(質量分數)豆餅粉，以提高酶活力。制備種子時，則可以酌情補充0.2%～1%(質量分數)(NH4)2SO4，以提高孢子數。

2.4 培養條件的優化

以麩皮∶豆餅粉=1∶0.2(g∶g)，料水比1∶1.1(g∶mL)，按表4因素水平設計L934正交試驗，考察SP7-2菌株固態發酵產RSGA優化的工藝條件，試驗結果及方差分析分別見表4和表5。

表4 L934影響因子正交試驗因素水平及結果Table 4 Factors, levels and results of L934 multi-analysis test

注：雙控溫指前期10～12 h，恒溫32 ℃；中期至培養結束，恒溫35 ℃。

表5 L934影響因子正交試驗方差分析Table 5 Analysis of variance of L934 multi-analysis test

注：*代表差異顯著，P<0.01。

由表4直觀分析可知，SP7-2菌株固態發酵產RSGA工藝條件中，培養溫度影響最大(方差分析顯示影響顯著，見表5)，其次為翻拋間隔及植酸用量，初始pH影響最小，正交試驗所得優化工藝條件為：采取雙控溫培養、每24 h翻拋1次，添加0.3%(質量分數)植酸，初始pH 5.0。以此優化工藝固態培養所得RSGA平均值為5594 U/g。

2.5 發酵終點的確定(30 L固態發酵罐)

由圖1可明顯看出，SP7-2菌株固態發酵過程可分為3個特征階段：孢子萌發(0～12 h)、菌絲生長繁殖(12～60 h)、產孢子(60～120 h)。在此生長規律下，RSGA活力呈現先增加后降低的趨勢。在培養至60 h時，酶活力最高，為7 870 U/g。隨著孢子的大量生成，酶活力則急劇下降。據此，確定SP7-2菌株固態發酵產RSGA的發酵終點為60 h。若制備種子，則培養至120 h較佳。

圖1 SP7-2固態發酵孢子及酶活力曲線Fig. 1 Spore and RSGA activity curve of SP7-2 by SSF

3 結論和討論

溫度通過影響微生物體內酶的表達與分泌，從而影響微生物生長與代謝。由于不同種類微生物生長繁殖所需溫度不同，即使同一種微生物在不同的生理時期、對于不同的代謝產物所需溫度亦不同。因此，探索適宜的培養溫度是微生物培養過程中最重要的工作。試驗發現，SP7-2菌株孢子萌發最適溫度32 ℃，菌絲生長最適溫度35 ℃，孢子形成最適溫度37 ℃，與SP7-2菌株生長規律的階段性特征高度相似。試驗還發現，隨著菌絲的生長繁殖，SP7-2產RSGA活力亦大幅增加，RSGA活力上升與菌絲生長繁殖回歸方程為y=1 033.4x-1 656.6(R2= 0.822 6，12～60 h，菌絲生長繁殖期，x為孢子數，y為RSGA活力)，呈現顯著線性關系。

特別值得一提的是，SP7-2菌株菌絲生長到頂囊即將形成時RSGA活力最高。伴隨著氣生孢子的大量產生，RSGA活力則急劇下降，RSGA活力下降與孢子生成回歸方程為y=-50.713x+ 7 742.5(R2= 0.912 2，60～120 h，產孢子期，x為孢子數，y為RSGA活力)，呈現極顯著線性關系。據此，判斷營養菌絲是RSGA的主要來源，氣生菌絲或分生孢子梗RSGA活力甚低或根本沒有。此判據可作為工業制曲過程中RSGA活力在線檢測分析的重要形態指標，從而免去了繁瑣的理化指標測定。

以上動力學特征分析表明，RSGA屬偶聯型產物，其與SP7-2菌株的菌絲生長是同步的。因此，可通過提高SP7-2菌絲生長速度或增加菌體濃度來提高產量。據此，試驗采取階段式雙控溫培養：前期0～12 h恒溫32 ℃促進孢子萌發，中期12～60 h升溫至35 ℃間歇翻拋，促進營養菌絲生長及酶的積累，一旦菌絲頂囊即將形成(約60 h)，立刻升溫至40 ℃熱風烘干。結果表明，采用此雙控溫培養，可顯著提高RSGA活力，并能大大縮短產酶周期，且鏡檢發現菌絲柄比恒溫培養的粗短。

麩皮約含20%(質量分數)淀粉，還富含礦物質和維生素等生長因子，不僅為微生物生長繁殖提供必需的營養素，還可作為緩沖成分或促酵劑等維持適宜的生理pH范圍或提高酶活力。麩皮疏松透氣，作為主要固態發酵基質，結合適時翻拋，可為好氧菌的旺盛繁殖提供足夠的氧氣，是SP7-2菌株生長繁殖及發酵產酶的優良基質，可單獨使用或適當追加氮源等營養。由于麩皮(或與豆餅粉的混合物)自身pH為5.0～6.0， 實際固態發酵過程中，可采取自然pH，從而簡化制曲工藝。

特別值得關注的是，在培養基中添加微量的植酸可大大提高SP7-2菌株固態發酵RSGA產量與活力。植酸是一種表面活性劑，其促進酶產量與活力增加的原因主要是通過提高菌絲細胞膜通透性，從而提高氧的傳遞速度及基質中營養供給與細胞的吸收，進而提高微生物酶的表達與分泌[27]。前期試驗發現，植酸作為促酵劑可顯著提高黃曲霉糖化酶活力[28]，用于黑曲霉SP7-2菌株固態發酵產RSGA亦顯示積極效應。

綜上，試驗確定SP7-2菌株固態發酵產RSGA優化工藝為：麩皮為基質，復配20%(質量分數)豆餅粉，料水比1∶1.1(g∶mL)，添加0.3%(質量分數)植酸，初始pH自然，每24 h翻拋1次，采取雙控溫培養60 h。在此優化工藝條件下，30 L固態發酵罐中RSGA活力為7 870 U/g，是優化前的1.31倍。

黑曲霉SP7-2產RSGA活力的提高無疑給生料釀酒業又提供了一個重要的酶源，然而，其用于生料釀酒還需解決諸多如多菌種協調配比、用量、溫控、后處理等重要技術問題。因此，繼續采用高新技術研究SP7-2菌株生料曲的制備，探索其生料釀酒工藝對推動生料釀酒業的快速高質發展有重大的現實意義。