Bacillus cereus膠原蛋白酶功能基因分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測

劉麗莉，代曉凝，陳珂，孟圓圓，郝威銘

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023) 2(食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心(河南科技大學(xué))，河南 洛陽，471023)

我國是畜產(chǎn)品生產(chǎn)大國，牛骨資源豐富，然而只有少數(shù)的蛋白酶可以降解牛骨膠原蛋白，導(dǎo)致長期以來，我國絕大多數(shù)牛骨資源尚未得到有效地開發(fā)利用[1-2]。研究生物酶工程技術(shù)開發(fā)出功能性骨蛋白肽，可解決牛骨進(jìn)行深加工和牛骨資源浪費(fèi)問題，并具有一定的經(jīng)濟(jì)效益，也為我國畜禽骨骼資源的深度開發(fā)提供新思路。牛骨骼中的膠原蛋白經(jīng)酶解后，可以得到骨膠原多肽，它不僅能夠抗氧化、抗衰老、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等；且在營養(yǎng)吸收方面，比氨基酸或膠原蛋白效果更佳[3-5]。但由于牛骨膠原蛋白溶解性差，以及其特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)，使得牛骨膠原不易被普通的蛋白酶降解。此外，目前能降解骨膠原蛋白的蛋白酶具有底物專一性強(qiáng)，水解程度低的特點(diǎn)，與進(jìn)入工業(yè)化大生產(chǎn)還有一定距離。

目前微生物源牛骨膠原蛋白酶來源有溶組織梭菌[6],Bacillussp. DPUA 1728[7]，Clostridiumperfringens[8]，Vibriovulnificus[9]，和VibriovulnificusCYK279H[10]等，但是這些菌株大部分為致病菌，會(huì)與膠原蛋白酶同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前市售的膠原蛋白酶菌株很少[11-12]。所以，找出安全有效的膠原蛋白酶資源，并提高酶的降解效率成為牛骨膠原蛋白資源深度利用的關(guān)鍵問題。研究人員嘗試通過構(gòu)建工程菌株、基因定向改造、染色體重組等方式來提高原始菌株的產(chǎn)酶效率[13-19]。本研究以課題組篩選的高效降解骨膠原蛋白的菌株B.cereusMBL13-U為出發(fā)菌，測定其全基因組序列，然后采用軟件對產(chǎn)酶功能基因的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并將目的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主菌株BL21，構(gòu)建工程菌。通過此項(xiàng)研究以期為我國畜禽骨骼資源開發(fā)利用提供了新的研究思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,B.cereus) MBL13-U、宿主菌為大腸桿菌(EscherichiacoliBL21(DE3))、表達(dá)載體pET-30a均為課題組保藏菌株。

1.1.2 PCR引物

根據(jù)目的基因和表達(dá)載體設(shè)計(jì)出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增目的基因的引物。

上游引物序列：CGCGGATCCGCTCTCCCCT ACCTTACATT T(劃線處為BamH I的酶切位點(diǎn))。

下游引物序列：CCGCTCGAGTAAAAAGGTCGCCGTGAGTGG(劃線處為XhoI的酶切位點(diǎn))。

1.1.3 工具酶與主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、內(nèi)切酶(BamHⅠ和XhoⅠ)、T4 DNA連接酶、DNA Marker(DL5 000、DL12 000)、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，Marker TaKaRa公司；卡那霉素(Kana)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，北京索萊寶公司；DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，北京GENVIEW公司；基因組提取試劑盒，德國Analytik Jena公司；牛血清白蛋白，眾一生物公司；Agarose(AR)，德國Analytik Jena公司；50 X TAE(AR)，吉格生物科技(廣州)有限公司；牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白，源葉生物有限公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

B.cereusMBL13-U種子培養(yǎng)基：100 mL去離子水中分別加入牛肉膏1.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，自然pH。在121 ℃下滅菌20 min，冷卻待用。

LB培養(yǎng)基：在100 mL的去離子水中分別加入NaCl 1.0 g，酵母粉0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，在121 ℃下滅菌20 min，冷卻待用。

LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)：向100 mL的去離子水中加入NaCl 1.0 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1.0 g，于121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻后向其中加入50 mg/mL 卡那霉素100 μL。

固體培養(yǎng)基：加1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂于上述培養(yǎng)基中，即成相應(yīng)固體培養(yǎng)基。

1.1.5 儀器與設(shè)備

GeneAmp9700 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；DY04-13立式壓力滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝科技有限公司；LGJ-25C冷凍離心機(jī)，湘儀儀器(湖南)開發(fā)有限公司；JY600E SDS電泳儀、WD-9413A凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司；H1650離心機(jī)，湘儀儀器(湖南)開發(fā)有限公司；UV-1800紫外光譜掃描儀，日本島津公司；TM3030Plus掃描電鏡，日本Jeol有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全基因組測序

提取收集菌株的基因組送至上海源序生物科技有限公司測序。所得Solexa數(shù)據(jù)采用velvet V1.2.03軟件進(jìn)行拼接。

1.2.2 基因組數(shù)據(jù)分析

搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋，將拼接生成的基因組序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)預(yù)測、基因功能注釋分析、KEGG代謝途徑分析。

1.2.3 膠原蛋白酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測

在上述研究獲得的膠原蛋白酶功能基因序列的前提下，先采用DNA翻譯工具ExPASy將基因序列翻譯為相對應(yīng)的氨基酸序列，用SOPMA在線預(yù)測該蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)，利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺(tái)等工具對膠原蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[9]。

1.2.4 ColM13基因克隆

以提取的B.cereusMBL13-U基因組DNA為模板，使用設(shè)計(jì)出的一對特異性引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL， 上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaqDNA DNA聚合酶 0.15 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積25 μL。PCR擴(kuò)增過程為在94 ℃條件下反應(yīng)4 min進(jìn)行預(yù)變性；在95 ℃條件下反應(yīng)1 min進(jìn)行變性；在51 ℃條件下反應(yīng)1 min進(jìn)行退火；在72 ℃條件下反應(yīng)1.5 min進(jìn)行延伸；在72 ℃條件下反應(yīng)10 min終止延伸，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束在4 ℃條件下保存一段時(shí)間并抽取PCR產(chǎn)物，用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 大腸桿菌BL21感受態(tài)的制備

感受態(tài)細(xì)胞的制備在代軍[20]、張跡[21]的基礎(chǔ)上略加改善。本試驗(yàn)中采用預(yù)冷的已滅菌80 mmol/L MgCl2-20 mmol/L CaCl2溶液對菌體細(xì)胞進(jìn)行重懸，冰上冷卻25 min后離心；再采用已滅菌且預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液(含30%(體積分?jǐn)?shù))甘油)，輕輕振蕩使細(xì)胞重懸，然后將菌液以200 μL/管進(jìn)行分裝(冰上操作)，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組表達(dá)載體pET30a-ColM13及工程菌的構(gòu)建

在37 ℃條件下用BamHI、XhoI對純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-30a進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶對雙酶切的產(chǎn)物(酶切產(chǎn)物已進(jìn)行膠回收純化)進(jìn)行連接，完成重組表達(dá)載體pET30a-ColM13的構(gòu)建。在16 ℃下酶連3 h左右，將重組表達(dá)載體pET30a-ColM13轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21混勻，完成工程菌pET30a-ColM13/BL21的構(gòu)建。其中，轉(zhuǎn)化條件[22]為：冰上預(yù)冷30 min后在42 ℃條件下水浴熱激90 s；再次冰上預(yù)冷2～5 min后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中并加入已滅過菌的LB培養(yǎng)基，以37 ℃、180 r/min恒溫培育60 min。無菌條件下，抽取200 μL菌液涂于LB固體平板(含Kana)上，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單克隆菌落，接入5 mL LB培養(yǎng)液(含Kana)，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物離心，收集菌體并按質(zhì)粒提取試劑盒的說明書(GENVIEW公司)從工程菌中提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及序列測定。

1.2.7 重組蛋白酶ColM13的誘導(dǎo)表達(dá)

為檢驗(yàn)構(gòu)建出的工程菌是否能夠表達(dá)所需要的重組蛋白酶ColM13。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)采用IPTG誘導(dǎo)法，主要是在處于對數(shù)生長期的工程菌培養(yǎng)液中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))為100 mmol/mL的IPTG，在37 ℃的恒溫振蕩器以180 r/min的條件培養(yǎng)4 h，然后離心收集菌體進(jìn)行超聲破碎，再次離心，上清即為重組蛋白酶。最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測[23-24]。

1.2.8 重組蛋白酶ColM13 酶解骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)分析

1.2.8.1 紫外(UV)掃描分析

將骨膠原蛋白分別用BSC和ColM13進(jìn)行處理，在近紫外區(qū)對處理過的樣品進(jìn)行200～400 nm的全波長掃描。

1.2.8.2 掃描電鏡(SEM)分析

分別將膠原蛋白原樣與用ColM13處理的膠原蛋白經(jīng)真空冷凍干燥后進(jìn)行噴金處理后用掃描電鏡觀察表面結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因測序分析

2.1.1 Solexa數(shù)據(jù)拼裝

采用軟件velvet V1.2.03對Solexa數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，拼裝后共得到78個(gè)重疊群(Contig)，Contig的平均長度為73 449 bp，總長為5.7 Mb，其中最長的Contig為683 kb。拼裝結(jié)果詳見表1。

表1 拼裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 The results of assemble

2.1.2 基因預(yù)測

通過glimmer 3.02 對出發(fā)菌株的基因組進(jìn)行基因預(yù)測，結(jié)果如表2。

表2 基因預(yù)測的結(jié)果Table 2 The results of gene prediction

可知其含5 989個(gè)基因；通過tRNA-scan發(fā)現(xiàn)84個(gè)tRNA序列；使用RNA mmer分析軟件從菌株的基因組中預(yù)測出6個(gè)rRNA序列。圖1顯示基因長度的分布情況。

圖1 基因長度分布Fig.1 The fraction of gene length

由圖1可知，基因長度在0.5 kb以下的為36.0%，基因長度在0.5～1 kb以下的為35.6%，基因長度在1～1.5 kb以下的為18.8%。綜上可知，90%以上的基因長度都在1.5 kb以下。

2.2 基因功能注釋及代謝途徑分析

搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫對所測膠原蛋白酶進(jìn)行基因功能注釋，利用CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行COG分類。通過KEGG數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路。分析可知共有5 831個(gè)蛋白具有生物學(xué)功能。3 715個(gè)蛋白具有COG分類，結(jié)果見圖2；1 610個(gè)蛋白具有KEGG的同源基因(ortholog)，結(jié)果見圖3；所有蛋白匹配的同源蛋白來源于341個(gè)物種，分類情況如圖4所示。

圖2 COG功能統(tǒng)計(jì)Fig. 2 The function statistics of COG

圖3 KEGG代謝通路的類型Fig. 3 The type of KEGG metabolic pathway

圖4 同源蛋白的類型Fig. 4 The type of homologous protein

由圖2可知，COG功能主要包括：氨基酸、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；細(xì)胞與染色體的分裂等。由圖3可知，KEGG代謝通路的類型主要分為四大類：(1)代謝；(2)遺傳信息處理；(3)環(huán)境信息處理；(4)細(xì)胞過程。

其中，代謝主要為各種物質(zhì)及能量的代謝；遺傳信息處理主要指的是：轉(zhuǎn)錄，翻譯，折疊、排序和退化，復(fù)制和修復(fù)；環(huán)境信息處理包括：膜運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子和交互；細(xì)胞過程指的是細(xì)胞運(yùn)輸和分解代謝、細(xì)胞活性、細(xì)胞生長和死亡、細(xì)胞群體。由圖4可知，所有蛋白匹配的同源蛋白中Bacilluscereus比例最高，達(dá)到47.9%。

2.3 功能基因的定位

經(jīng)過上述基因組數(shù)據(jù)分析，從全基因組序列中得到膠原蛋白酶的功能基因序列長度為2 916 bp。序列號為CP023179.1。

2.4 膠原蛋白酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)獲得的目的基因序列，通過SOPMA在線預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該功能基因中α螺旋占總氨基酸的37.1%，β轉(zhuǎn)角占總氨基酸的12.8%，無規(guī)則卷曲占總氨基酸的26.0%。利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺(tái)等工具對膠原蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。

A-模塊結(jié)構(gòu);B-三級結(jié)構(gòu)圖5 膠原蛋白酶的模塊結(jié)構(gòu)和膠原蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Module structure of collagenase and prediction of the tertiary structure of collagenase

由圖5-A可知，NCBI的BLASTp分析結(jié)果表明膠原酶含有的4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：氨基酸殘基序列中97～279位是M9肽酶家族N端結(jié)構(gòu)域(peptidase family M9N-terminal)，該結(jié)構(gòu)域最初從微生物來源的膠原酶-金屬蛋白酶中發(fā)現(xiàn)；氨基酸殘基序列中從359～621位是谷氨酸-鋅肽酶家族結(jié)構(gòu)域(collagenase)，這個(gè)酶家族主要用于分解膠原蛋白；氨基酸殘基序列中的774～843位是多囊性腎病蛋白結(jié)構(gòu)域(PKD)，PKD結(jié)構(gòu)域可能是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用中的配體，在結(jié)合位點(diǎn)處起作用；氨基酸殘基序列891～956位是細(xì)菌前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域(bacterial pre-peptidaseC-terminal domain)，該結(jié)構(gòu)域通常在分泌的細(xì)菌肽酶的C端發(fā)現(xiàn)，它們可能與PKD(pfam00801)結(jié)構(gòu)域所發(fā)揮的作用相類似。

將所得的膠原蛋白酶基因序列在Phyre2在線分析平臺(tái)模擬其三維結(jié)構(gòu)，由圖5-B可知，該蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出鑷子狀結(jié)構(gòu)。

2.5 ColM13基因克隆

由圖6可知，在2號泳道均出現(xiàn)目的條帶，大小約2 916 bp與預(yù)期的ColM13基因片段大小相符。采用DNA回收試劑盒快速純化回收PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，抽取樣品送至北京六合華大公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明PCR結(jié)果正確。

M-DL 5 000 Marker；1-擴(kuò)增的目的片段圖6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測Fig.6 PCR amplification product detection

2.6 重組子的檢測

由圖7-A可知，泳道2和3種酶切重組子后并未出現(xiàn)兩條條帶；泳道4出現(xiàn)2條條帶，說明挑取的3個(gè)工程菌的菌落中泳道4的菌落可能重組成功。因此就泳道4提取的工程菌的質(zhì)粒增加對照類型，電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖7-B所示。結(jié)合圖7-B可知，泳道7雙酶切后的工程菌的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條條帶，其中上方條帶為酶切后的質(zhì)粒條帶，下方條帶為酶切后目的基因條帶，并且這兩條條帶與pET-30a(+)空載體和PCR擴(kuò)增出ColM13的基因片段大小基本一致。由此得出，工程菌pET-30a-ColM13/BL21(DE3)已成功構(gòu)建。

A-M：DL 5 000 Marker；1：單酶切后pET-30a(+)質(zhì)粒載體；2-4：雙酶切后重組質(zhì)粒；B-M：DL 12000 Marker；泳道1：原目的片段；泳道2：pET-30a(+)空質(zhì)粒；泳道3：雙酶切后目的片段；泳道4：雙酶pET-30a(+)質(zhì)粒；泳道5：重組質(zhì)粒；泳道6：單酶切后pET-30a(+)質(zhì)粒；泳道7：雙酶切后重組質(zhì)粒圖7 重組子酶切驗(yàn)證Fig. 7 The enzyme digestion verification of the recombinant

2.7 ColM13的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)過對ColM13誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化，將工程菌pET30a-ColM13/BL21和空質(zhì)粒菌pET30a/BL21在37 ℃的條件下加入為6‰的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。ColM13表達(dá)情況如圖8所示。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker；1-pET-30a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2-重組子轉(zhuǎn)入后未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3-重組子轉(zhuǎn)入后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)圖8 SDS-PAGE檢測Fig. 8 SDS-PAGE detect

由圖8可知，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌相比，加入IPTG誘導(dǎo)后構(gòu)建的工程菌中的目的蛋白質(zhì)得到表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白與Marker進(jìn)行對比，其分子質(zhì)量約為46 kDa。

2.8 UV光譜分析

膠原蛋白肽鏈中的-C=O、-COOH、-CONH2為生色基團(tuán)，蛋白質(zhì)溶液形成紫外吸收光譜即是蛋白分子中各種紫外生色基團(tuán)加和的結(jié)果[25]。本實(shí)驗(yàn)的紫外圖譜檢測結(jié)果如圖9所示。

圖9 膠原蛋白酶解前后的紫外光譜分析Fig.9 Analysis of UV spectrum before and after enzymatic hydrolysis of collagen

2.9 ColM13作用于膠原蛋白的掃描電鏡分析

將表達(dá)的ColM13作用于膠原蛋白，對酶解前后的膠原蛋白進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果如圖10所示。

A-膠原蛋白原樣；B-ColM13處理的膠原蛋白圖10 膠原蛋白酶解前后的掃描電鏡圖Fig.10 The SEM of collagen before and after enzymatic hydrolysis

由圖10可知，將誘導(dǎo)表達(dá)出的ColM13酶作用于膠原蛋白后，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。其中，膠原蛋白呈現(xiàn)為顆粒狀結(jié)構(gòu)，表面凹凸不平，但顆粒的整體性較好；但經(jīng)ColM13處理后膠原蛋白的結(jié)構(gòu)由顆粒狀轉(zhuǎn)變成層狀或者片段分列，表面均勻、細(xì)膩光滑，這是由于ColM13將膠原蛋白降解為小分子多肽，破壞了其分子表面結(jié)構(gòu)[28]，從而表明ColM13在工程菌中已成功表達(dá)。

3 結(jié)論

(1)本研究將課題組篩選的B.cereusMBL13-U作為目標(biāo)菌株，根據(jù)其全基因組測序分析獲得產(chǎn)酶的功能基因序列，采用velvet V1.2.03對數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，搜尋NCBI的NR庫、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋，確定膠原蛋白酶的基因序列長度為2 916 bp。

(2)采用SOPMA在線預(yù)測可知該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該功能基因中α螺旋占總氨基酸的37.1%， β轉(zhuǎn)角占總氨基酸的12.8%，無規(guī)則卷曲占總氨基酸的26.0%。利用NCBI的BLAST工具以及Phyre2在線分析平臺(tái)等工具對膠原蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，表明該膠原蛋白酶呈現(xiàn)為鑷子狀三維結(jié)構(gòu)。

(3)以B.cereusMBL13-U基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段克隆至質(zhì)粒pET-30a，成功構(gòu)建出表達(dá)型工程菌大腸桿菌(E.coliBL21(DE3))，通過全波長紫外掃描光譜和掃描電鏡對工程菌所產(chǎn)的工程蛋白酶ColM13酶解Ⅰ型骨膠原蛋白后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。表明工程菌構(gòu)建成功，這對骨膠原蛋白酶結(jié)構(gòu)特性的相關(guān)研究及其在生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。