啟動子串聯及改造提高FAD為輔基的葡萄糖脫氫酶在Bacillus subtilis中的表達

張玲，林榮，宋祖坤，王男，楊海麟*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122) 2(蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司，江蘇 蘇州， 215000)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)被廣泛應用于血糖指標的臨床生化檢測。近些年發現葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)具有替代葡萄糖氧化酶的應用潛力，因其不以氧氣為電子受體，不受溶解氧的限制，檢測結果誤差更小[1-2]。葡萄糖脫氫酶按照輔基或輔酶差異可分為[3]：(1)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(hicotinamide adenine dinucleotide, NAD(P)+)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(NAD(P)-GDH,EC 1.1.1.47)。(2)以吡咯并喹啉醌(pyvrolidine quinoline quinone, PQQ)為輔基的葡萄糖脫氫酶(PQQ-GDH,EC 1.1.5.2)。(3)以黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)為輔基的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH，EC 1.1.99.10)。其中FAD-GDH以輔基結合緊密，催化效率較高，可作為替代目前診斷用葡萄糖氧化酶的首選。

具有活性的FAD-GDH可能為單體[4]或同源二聚體[5]。FAD-GDH主要來源于絲狀真菌[6]，如：Penicilliumsp.[7]，Mucorsp.[8]，Aspergillussp.[9-10]，Glomerellacingulata[11]等，重組表達和純化較為困難。來源于Glomerellacingulata的FAD-GDH在E.coli中重組表達，常常需要與分子伴侶系統共表達才能實現可溶性表達，蛋白純化和放大生產較為困難[11]。在酵母菌中表達量較高，但存在糖基化修飾，會干擾血糖檢測電極的靈敏度，實際生產應用中需進行酶的去糖基化步驟[12]。

FAD-GDH罕見于細菌。本團隊先前嘗試將來源于細菌Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在大腸桿菌中表達，該酶熱穩定性好，Tm值可達77 ℃。為了探索該基因在其他宿主的表達情況，本文嘗試將來源于原核Burkholderiacepacia的gdh基因在枯草芽孢桿菌表達系統中表達。枯草芽孢桿菌作為表達宿主，遺傳背景清楚，對培養基要求較低，生長快速，不產內毒素，適用于原核生物來源重組蛋白的分泌表達。

篩選高效的啟動子可實現外源基因在枯草芽孢桿菌中高效表達。啟動子依據是否需要誘導分為：(1)組成型啟動子，如P43，PHpaⅡ，PamyQ’;(2)誘導型啟動子，如Popuaa，Pgsib。組成型的啟動子能在菌體內持續進行基因表達，受環境因素的影響較少，或變化很小。誘導型啟動子在誘導因子存在下，相應的基因被激活，基因表達，積累目的產物[13]。許多研究表明雙啟動子相比單啟動子更能促進外源基因的表達。重組菌株B.subtilisCCTCCM 2016536用于表達β-環糊精糖基轉移酶，雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ’表達系統的表達量是單個啟動子PamyQ’表達系統表達量的1.3倍，主要由于雙啟動子下外源基因轉錄水平高于單啟動子[14]。啟動子PAmyR2和啟動子Pblma分別插入PHpaII啟動子的下游，4-α-葡聚糖轉移酶的表達量和單啟動子PHpaII比較分別提高11、12倍[15]。雙啟動子PHpaII-PgsiB表達氨肽酶分別是單個PHpaII和PgsiB啟動子表達的2.3和2.2倍[16]。

將啟動子突變改造也是提高枯草芽孢桿菌產物積累的有效辦法。碳源代謝在菌體發酵過程中占有重要地位，表達外源產物的過程中碳代謝產物例如葡萄糖等，會對目的產物的生成產生抑制作用，即碳代謝產物抑制(carbon catabolite repression,CCR)，這種抑制作用主要是通過碳代謝控制蛋白A (carbon catabolite protein A,CcpA) 復合物結合到啟動子區域的cre位點抑制轉錄[17]。cre位點的突變可有效地減少CcpA介導的碳代謝抑制作用。NICHOLSON等通過隨機突變篩選得到抗碳代謝產物的淀粉酶生產菌株，經過測序發現amyE啟動子的cre序列中GC堿基突變成AT[18]。NAGARAJAN等克隆來自高產淀粉酶的BacillussubtilisKCC103菌株的啟動子amyR4，該啟動子能夠有效地抵抗碳代謝產物的抑制，實現異源蛋白的高效表達，序列研究表明啟動子轉錄起始位點上游cre序列中+4(C-T)，-7(T-A)堿基發生突變[19]。

本研究嘗試將Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在蛋白酶缺陷型菌株B.subtilisWB600中進行表達，通過啟動子篩選、串聯及改造等策略，以期獲得FAD-GDH高表達量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

葡萄糖脫氫酶基因(gdh)由南京金斯瑞合成，構建于載體pUC57；E.coliJM109，B.subtilis168，B.subtilisWB600菌株由實驗室保存(表1)。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、蛋白質Low Marker、DNA Marker均購自大連寶生物有限公司；PCR產物回收試劑盒；DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工股份有限公司；其他所用試劑均購于國藥集團藥業股份有限公司。

1.1.3 培養基及緩沖液

(1) LB培養基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，加入2%(質量分數)的瓊脂即為LB固體培養基。(2) TB培養基(g/L)：甘油4.0，酵母粉24.0，蛋白胨12.0，溶解在800 mL去離子水中，高壓滅菌后冷卻至40 ℃加入200 mL滅菌的緩沖液(K2HPO416.4 g，KH2PO42.32 g，溶解于去離子水中，定容至200 mL，0.22 μm的濾膜過濾除菌或高壓滅菌)。(3) 抗 生素溶液：先配置成質量濃度為100 mg/mL的母液，然后用0.22 μm的濾膜過濾除菌，用小的EP管分裝，置于-20 ℃ 保存。(4) 磷酸鉀緩沖液(phospate buffered,PB，50 mmol/L， pH 7.0)：取86 mL的0.1 mol/L K2HPO4，加入14 mL的0.1 mol/L KH2PO4，再加入100 mL水，調節pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pMA5-1的構建

以質粒pUC57-gdh為模板進行PCR擴增，引入BamHⅠ/MluⅠ位點，擴增產物回收雙酶切，與同樣雙酶切的質粒pMA5連接，構建表達質粒pMA5-1。

1.2.2 串聯啟動子重組質粒的構建

以B.subtilis168的DNA為模板，利用引物PamyQ’-F/PamyQ’-R，P43-F/P43-R，PgsiB-F/PgsiB-R, Popuaa-F/ Popuaa-R，分別PCR擴增相應的啟動子序列，同時引入NdeⅠ/MluⅠ位點，雙酶切啟動子序列與同樣雙酶切的質粒pMA5-1連接，構建雙啟動子質粒pMA5-1n(表2)。

1.2.3 培養方法

種子液的制備：從卡納抗性的固體培養基上，挑取重組菌B.subtilis單菌落，接種到LB液體培養基，37 ℃，200 r/min搖床培養8 h。

表2 實驗所用引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

搖瓶發酵培養：以體積分數4%轉接種子液于發酵培養基中，30 ℃，220 r/min，培養48 h。

1.2.4 菌體生物量測定

取20 mL不同濃度的菌液，8 000 r/min離心10 min， 用pH 7.0，50 mmol/L的PB緩沖液清洗2次，測定濕重，105 ℃烘干至恒定值，稱取干重。菌體濕重約是干重的3.8倍。

1.2.5 葡萄糖脫氫酶酶活測定及SDS-PAGE分析

酶活定義：在一定條件下，每分鐘還原1 μmol DCPIP所需的酶量定義為一個酶活單位。

取100 μL適當稀釋的酶液，加入3 mL顯色液(50 mmol/L pH 7.0的PB緩沖液， 0.03 mmol/L的DCPIP，1.6 mmol/L的PMS，100 mmol/L的葡萄糖溶液)輕輕混勻，用重蒸水調零，37 ℃每隔1 min記錄600 nm處吸光值的變化，共記錄2～3 min。

用酶的緩沖液代替酶液作為對照。

采用5%的濃縮膠與15%的分離膠，pH 8.3的Tris-Gly電泳緩沖液，90 V恒壓，將剝離電泳后的膠，染色，脫色。膠的具體配置操作方法參照SDS-PAGE試劑盒。

1.2.6 基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜分析

樣品處理：(1)用刀片切下膠上目標條帶，放入離心管中；(2)加入400 μL脫色液脫色，清洗至透明，去除上清，凍干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重復1次，晾干，膠粒應為白色；(3)加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3，10 μL 100 mmol/L DTT，56 ℃ 放置30 min； (4)去上清，加100 μL 100%乙腈，5 min后吸去；(5)加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3，30 μL 200 mmol/L IAA，暗處理20 min；(6)去上清，加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，室溫放置15 min；(7)去上清，加入100 μL 100%乙腈，5 min后吸去，凍干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重復1次，晾干，膠粒應為白色；(8)加入6 μL酶液，4 ℃放置30～60 min，使膠塊充分吸漲；(9)加入20 μL 25 mmol/L NH4HCO3緩沖液，37 ℃放置20 h左右；(10)取0.6 μL酶解液點樣，自然晾干，覆蓋0.6 μL基質，晾干。進行上機質譜分析，并將得到的結果導入NCBI網站比對。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pMA5-1的構建表達及蛋白質譜鑒定

將gdh基因構建到pMA5上轉入B.subtilis，研究是否能夠表達具有活性的FAD-GDH。將pMA5-1轉化E.coliJM109，經過氨芐抗性平板篩選，從陽性轉化子中提取質粒，利用BamHⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗證，驗證結果如圖1，凝膠電泳條帶與目的基因大小一致，并將驗證正確的基因測序，與目的序列比對，結果表明構建成功。

M-DNA marker；1-pMA5-1雙酶切產物圖1 pMA5-1雙酶切驗證Fig.1 Identification of pMA5-1 by restriction digestion

將構建成功的質粒pMA5-1轉入B.subtilis感受態WB600，從含有卡納抗性的平板上挑選陽性克隆，獲得重組菌株WB1，將獲得的重組菌搖瓶發酵培養48 h，菌體離心收集，細胞破碎，上清離心，測得酶活為962 U/L，并將離心獲得的上清取30 μL，加入10 μL 4×SDS-PAGE的上樣緩沖液，煮沸10 min，進行SDS-PAGE檢測，結果見圖2，由于空白對照處也存在一條60 kDa的條帶，所以將WB1破壁上清SDS-PAGE圖譜中60 kDa處的條帶切膠回收，進行飛行質譜分析，比對結果顯示與目的條帶匹配度最高的為來源于Burkholderiacepacia的葡萄糖脫氫酶，分子質量60 kDa，進一步表明FAD-GDH在B.subtilisWB600中表達成功。

M-蛋白質marker；1-對照；WB0-破壁上清；2-WB1破壁上清圖2 B. subtilis表達FAD-GDH SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification of B. subtilis expression FAD-GDH

2.2 串聯啟動子提高FAD-GDH的表達

采用雙啟動子串聯策略來提高FAD-GDH的表達量，本文選取的啟動子見表3。啟動子PHpaⅡ是質粒pMA5上自帶的啟動子，本文選取其他4種啟動子串聯在PHpaⅡ下游構建含有雙啟動子。其中PamyQ’和P43為組成型的啟動子，具有強啟動性、無需添加誘導劑可直接產生目的蛋白的優勢；PgsiB和Popuaa為鹽誘導型啟動子，受鹽濃度激活調控目的蛋白大量產生的特點。4種雙啟動子表達質粒pMA5-11(PHpaII-PamyQ’)，pMA5-12(PHpaII-P43)，pMA5-13(PHpaII-PgsiB)，pMA5-14(PHpaII-Popuaa)構建流程見圖3。

以B.subtilis168基因組為模板進行PCR擴增相應的啟動子序列，擴增產物回收雙酶切插入啟動子PHpaII的下游，分別獲得重組質粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14。利用NdeⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗證，驗證結果如圖4，并將驗證正確的基因測序，與目的序列比對，比對結果表明構建成功。

分別將構建成功的質粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14，轉化感受態B.subtilisWB600，從含有卡納抗性的平板上挑選陽性克隆，獲得菌株WB11，WB12，WB13，WB14，以及含有單啟動子PHpaⅡ的重組菌WB1，將獲得的上述重組菌與含有單啟動子PHpaⅡ的重組菌WB1分別搖瓶發酵培養48 h，菌體離心收集，細胞破碎。

表3 本文所構建的來源于B. subtilis的啟動子Table 3 The promoter from B. subtilis used in this study

圖3 串聯啟動子載體pMA5-1n的構建流程Fig.3 Construction procedure of double promoter vector pMA5-1n

不同啟動子的強度通過測定菌體胞內酶活來衡量。PamyQ’和P43為組成型的啟動子[21-23]，PgsiB和Popuaa為鹽誘導型啟動子[24-26]，受鹽濃度激活，可利用質量濃度為4 g/L的NaCl進行誘導表達。含單啟動子PHpaⅡ重組菌株WB1及4種雙啟動子重組菌WB11，WB12，WB13，WB14的胞內酶活分別為924、2 497、 578、740、878 U/L(圖5-a)。其中含有組成型啟動子PamyQ’的雙啟動子重組菌WB11 (PHpaⅡ-PamyQ’)胞內酶活最高，約是酶活最低的重組菌株WB12的4倍，是單啟動子PHpaⅡ表達FAD-GDH酶活的2.7倍。分別取30 μL上述離心獲得的上清加入10 μL 4×的上樣緩沖液，煮沸10 min，進行SDS-PAGE檢測，結果見圖5-b， 重組菌發酵液在60 kDa處都有目的蛋白產生。

M-DNA marker；1-pMA5-11雙酶切產物；2- pMA5-12雙酶切產物；3-pMA5-13雙酶切產物；4-pMA5-14雙酶切產物圖4 雙啟動子載體pMA5-1n雙酶切驗證Fig.4 Identification of double promoter vector pMA5-1n by restriction digestion

a-含雙啟動子重組B.subtilis產FAD-GDH的酯活水平和菌體量；b-含雙啟動子重組B.subtilis表達FAD-GDH的SDS-PAGE鑒定M-蛋白質marker；1-WB1破壁上清；2-WB11破壁上清；3-WB12破壁上清；4-WB13破壁上清；5-WB14破壁上清圖5 雙啟動子表達FAD-GDH結果及SDS-PAGE鑒定Fig.5 Result of double promoter expression FAD-GDH and SDS-PAGE identification

2.3 刪除啟動子PamyQ’上cre位點促進FAD-GDH的發酵產酶

上述研究中表明最佳的串聯雙啟動子PHpaII-PamyQ’使酶活提高到2 497 U/L，具有促進該酶表達的效果，但有研究表明PamyQ’啟動子在發酵過程中會受到葡萄糖濃度的抑制，隨著葡萄糖濃度的增加會明顯抑制產酶[14]。本研究先考察葡萄糖是否會嚴重抑制串聯啟動子PamyQ’突變菌株的發酵產酶。比較不同濃度的葡萄糖和甘油條件下該突菌變株的發酵產酶情況。

將改造前重組菌WB11(含有雙啟動子PHpaII-PamyQ’)發酵培養48 h，收集菌體，酶活驗證是否存在碳代謝產物抑制效應。結果如圖6，通過測定酶活檢測FAD-GDH的表達情況，隨著培養基碳源的葡萄糖或甘油濃度的增加，菌體量上升，酶活逐漸下降。未添加葡萄糖，菌體胞內酶活是添加30 g/L的葡萄糖培養菌體胞內酶活的1.5倍；當未添加甘油，胞內酶活是添加3%(體積分數)的甘油胞內酶活的2倍，說明串聯啟動子PamyQ’后碳源濃度增加會抑制產酶。

a-不同質量濃度葡萄糖對改造前后重組菌產酶的影響；b-不同體積分數甘油對改造前后重組菌產酶的影響圖6 改造前后重組菌產FAD-GDH水平及菌體生長情況Fig.6 FAD-GDH expression and cell growth of reconstituted bacteria before and after transformation

枯草芽孢桿菌中，碳代謝產物的抑制效應主要是通過碳代謝控制蛋白CcpA，結合到啟動子區域的cre位點抑制轉錄。cre位點是一段含有回文結構，存在一些堿基保守的序列。CcpA如何與多樣的cre位點結合，具體的機制還不清楚，但改造和移除該位點可有效減少碳代謝的抑制[18-19]。

為了減少碳代謝產物的抑制效應，基于雙啟動子PHpaII-PamyQ’，通過重疊延伸PCR[27]移除PamyQ’啟動子中14個核苷酸的cre位點，構建雙啟動子PHpaII-PamyQ2，轉入B.subtilisWB600，構建WB2重組菌，發酵培養基添加30 g/L的葡萄糖，菌體胞內酶活力達3 626 U/L， 約是啟動子改造前添加30 g/L的葡萄糖菌體胞內酶活的2.2倍。如圖7-b重組菌株WB2發酵培養基中添加2%(體積分數)的甘油菌體胞內酶活力達3 119 U/L，是改造之前重組菌株WB11添加2%的甘油菌體胞內酶活的2.1倍。重組菌株WB111發酵培養中添加3%的甘油胞內酶活比添加2%的甘油有所下降，可能是過多的碳源導致菌體生長過快，抑制重組蛋白表達。

為了驗證改造后的重組菌WB2，培養時添加高濃度的葡萄糖是否會抑制FAD-GDH的表達，向培養基中分別添加40、50、60、70 g/L的葡萄糖，測定破碎菌體上清中的酶活及菌體干重，結果如圖7，隨著葡萄糖濃度的上升，菌體干重趨于穩定，可能是菌體生長受到溶解氧濃度的限制，胞內酶活隨著葡萄糖濃度上升而下降，過快的生長速度導致質粒丟失。培養基添加30～40 g/L的葡萄糖，一定程度上促進菌體生長及酶的表達，刪去啟動子PamyQ’的cre位點可減少碳源代謝產物對基因轉錄的抑制，促進外源基因表達。

圖7 高濃度葡萄糖對改造后重組菌WB2生長及FAD-GDH表達的影響Fig.7 FAD-GDH expression and cell growth of recombinant WB2 with more glucose

3 結論

構建含有單啟動子PHpaⅡ的重組質粒pMA5-1，轉入B.subtilis，測定酶活及飛行時間質譜鑒定表明重組菌表達了具有活性的FAD-GDH。分別選取2種組成型啟動子(PHpaⅡ-PamyQ’，PHpaⅡ-P43)和兩種鹽誘導型啟動子(PHpaⅡ-PgsiB，PHpaⅡ-Popuaa)串聯成雙啟動子分別表達FAD-GDH，含組成型雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ’的重組B.subtilis，胞內表達量最高為2 497 U/L，PHpaⅡ-PamyQ’雙啟動子表達強度增加可能是由于轉錄強度增加。本實驗中采用的其他雙啟動子表達FAD-GDH的活性低于單啟動子，可能是啟動子之間的排列順序會影響啟動之間的相互作用，靠近異源基因的啟動子可能會更大程度地影響外源基因的表達[28]。在PHapII與gdh基因之間插入不同的啟動子后，其RBS也被隨之替換為新插入啟動子的RBS，因此酶活性的變化也很有可能是由于翻譯強度的變化引起的。

發酵過程中，發現葡萄糖和甘油會抑制串聯啟動子PamyQ’突變株的發酵產酶，存在碳代謝產物抑制效應。為了減少發酵中的碳代謝抑制，采取刪去PamyQ’啟動子中與碳代謝阻遏因子結合的cre位點，構建的含有缺失cre位點的雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ2重組B.subtilis，使FAD-GDH酶活從2 497 U/L提高到3 626 U/L， 說明啟動子PamyQ’中cre位點的刪除有效地減少了碳源代謝產物對基因轉錄的抑制，促進外源基因表達。