一株耐鹽蛋白酶高產菌的篩選與初步鑒定

姚凌妍 沈建華

摘? ?要：分離篩選耐鹽的蛋白酶高產菌并加以鑒定。從廚余垃圾存放處土壤中分離細菌，利用蛋白水解透明圈初篩蛋白酶高產菌，并進行蛋白酶高產菌的耐鹽試驗，對所得的耐鹽蛋白酶高產菌進行革蘭氏染色與半固體穿刺培養。從土壤中分離得到19個單菌落，在初篩培養基上點種接種，有4株有比較明顯的水解透明圈，其中P2，P3為蛋白酶高產菌，耐鹽試驗表明P3最適鹽濃度為2%，為耐鹽高產菌株。P3革蘭染色陽性，桿狀，產芽孢，好氧，有鞭毛。從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到一株耐鹽的蛋白酶高產菌P3，為高滲條件下發酵生產蛋白酶提供了一種可能的菌種。

關鍵詞：蛋白酶? 耐鹽? 初篩? 鑒定

堿性蛋白酶、α-淀粉酶及糖化酶是三大工業酶制劑，其總產量約占酶類制劑的80%以上。催化蛋白質水解的酶稱為蛋白酶，其中堿性條件下能水解蛋白質中肽鍵的酶即堿性蛋白酶，其最適pH在9～11范圍內，廣泛應用于洗滌劑、食品、醫療、釀造、絲綢、制革等行業。因此，蛋白酶的生產在酶制劑乃至整個生物技術產業中占有重要的地位。蛋白酶廣泛分布于動物、植物與微生物中。由于植物受生長地域、季節、氣候等的影響，生產酶制劑的產量、質量都不穩定。動物產生的酶主要從屠宰牲畜的腺體中提取，來源有限。只有微生物生產的酶，可滿足任何規模的需求，產率高、質量穩定。同時，微生物產生的蛋白酶通常為胞外酶，分泌到發酵液中，相較于動植物來源的蛋白酶，分離純化的難度大大降低。工業上規模化培養微生物時，出于提高產率的考量，一般培養液的濃度盡量提高，這就要求發酵菌種能夠耐受較高的滲透壓，往往使用耐高鹽的菌種。耐鹽的蛋白酶高產菌菌種的選育成為蛋白酶生產的關鍵。

本文擬從土壤中分離細菌，篩選出耐鹽的蛋白酶高產菌，并進行初步鑒定，以期為蛋白酶生產提供可能的細菌菌株。

1? 材料與方法

1.1 土壤樣品稀釋液

從南京科技職業學院校園內廚余垃圾存放處土地采集土樣，五點取樣，取表層以下5～10cm處的土樣，混勻，放入無菌的袋中備用。實驗時稱土樣1g，迅速倒入帶玻璃珠的99mL無菌水瓶中振蕩5～10min，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。用無菌移液管吸10-2的土壤懸液1mL，放入9mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復，可依次制成10-3～10-8的稀釋液[1]。

1.2 土壤細菌的分離

1.2.1 營養瓊脂培養基

牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，加水至1000mL，調pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.2.2 土壤稀釋液平板澆注

取1mL土壤稀釋液接種至無菌培養皿，待培養基降溫至50℃趁熱倒平板，混勻，待平板凝固后，倒置，37℃恒溫培養箱培養24h，獲得細菌菌落。

1.2.3 分離培養基

牛肉膏2g，瓊脂15g，加水至800mL，121℃滅菌20min，脫脂牛奶200mL單獨滅菌，105℃，20min，各自滅菌后趁熱混合，自然pH。倒入無菌培養皿，即得劃線分離平板[2]。

1.2.4 平板劃線分離

從混勻澆注的平板上挑取單菌落，在無菌平板上進行三區劃線分離，獲得純種。

1.3 蛋白酶產生菌的初篩

1.3.1 初篩培養基

脫脂奶粉10g，瓊脂10g，加水至1000mL，0.06MPa，115℃高壓滅菌10min。趁熱倒平板。

1.3.2 平板透明圈法初篩

將劃線分離得到的純種分別點種于初篩培養基上，每個平板點種2個菌株，倒置，37℃恒溫培養箱培養24h，測量所接菌株的水解圈的直徑（Dh）與菌落的直徑（Dc）。根據Dh與Dc的比值，確定各個菌株產蛋白酶能力的強弱，從而篩選出蛋白酶高產菌[3]，見表1。

1.4 蛋白酶高產菌的耐鹽試驗

1.4.1 耐鹽試驗培養基

肉湯培養基中分別添加0%～9%（w/v）不等的氯化鈉，調pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.4.2 耐鹽試驗

取初篩培養基上水解透明圈明顯的菌落，用接種環刮取一環，接入50mL肉湯培養基中，25℃恒溫搖床150r/min震蕩培養18h至OD600為0.5作為種子液。在100mL不同氯化鈉濃度的肉湯培養基中分別準確接入1mL種子液，25℃恒溫搖床150r/min震蕩培養18h，測定OD600[4]。

1.5 耐鹽蛋白酶高產菌的初步鑒定

1.5.1 革蘭氏染色

用革蘭氏染色試劑盒進行革蘭氏染色，觀察細菌形態。

1.5.2 半固體穿刺培養

用接種針挑取耐鹽蛋白酶高產菌，在半固體培養基上穿刺接種，考察其有無鞭毛及需氧情況。

2? 結果與討論

2.1 土壤細菌分離與純化結果

從南京科技職業學院校內廚余垃圾存放處土壤樣品中，稀釋倒平板并在分離培養基上劃線分離得到19個菌落，依次編號。

2.2 蛋白酶產生菌初篩結果

19個單菌落點種于初篩培養基上，有4個能夠產生比較明顯的透明圈，4個菌株的Dh、Dc以及Dh/Dc見表1。比較不同菌株的Dh/Dc可知，P2與P3的Dh/Dc都在3以上，可初步判定為蛋白酶高產菌。

2.3 耐鹽試驗結果

蛋白酶高產菌P2與P3的耐鹽試驗結果見圖1。由圖可知蛋白酶高產菌P2能在含0%～6%氯化鈉的肉湯培養基中生長，最適鹽濃度為1%;而蛋白酶高產菌P3能在含0%～7%氯化鈉的肉湯培養基中生長，其最適鹽濃度為2%，且每個鹽濃度下，P3的光密度值都高于P2。因此，菌株P3是耐鹽的蛋白酶高產菌。

2.4 P3菌的初步鑒定

2.4.1 革蘭氏染色結果

P3菌株的革蘭氏染色結果見圖2。由圖可知，P3菌革蘭氏染色結果呈陽性，桿狀，產芽孢。

2.4.2 半固體培養結果

P3菌株半固體培養，在培養基表面及穿刺線上部生長，表明該菌為好氧菌，且從穿刺線向四周擴散生長，表明其具有鞭毛，能運動。

3? 結語

本文從南京科技職業學院存放廚余垃圾處的土壤中稀釋倒平板并劃線分離得到19個菌落，將分離得到的單菌落點種于初篩培養基上，得到4株水解透明圈較明顯的菌株P1、P2、P3以及P4，其中P2與P3的Dh/Dc值在3以上，初步判定為蛋白酶高產菌。再對P2以及P3進行耐鹽試驗，發現P3菌株能在含0%～7%氯化鈉的肉湯培養基中生長，且最適鹽濃度為2%，遠高于普通肉湯培養基中的0.5%的鹽濃度，具備耐鹽特性，因此P3菌具備耐高鹽蛋白酶高產菌的潛質。針對P3菌進行了初步的鑒定，革蘭染色陽性，桿狀，產芽孢，半固體穿刺培養試驗表明其具有鞭毛，好氧。P3菌是從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到的。由于其生存環境中存在豐富的蛋白質來源以及具備較高的鹽濃度的條件，所以易于分離得到耐鹽的蛋白酶高產菌。當然，P3菌的蛋白酶產生能力還需要進行復篩，并進行發酵液的酶活力測定，這是筆者下一步準備進行的工作。另外，本文只對P3菌進行了初步的鑒定，目前已知其形態特征為革蘭陽性，桿菌，產芽孢，好氧，有鞭毛能運動。后續還要通過一系列生理生化試驗，測定16S rRNA的基因序列，以及作P3菌的系統發育分析，才能確證其為何種屬的細菌。

總之，本文從廚余垃圾存放處的土壤中分離得到一株耐鹽的蛋白酶高產菌P3，并初步進行了形態學觀察和半固體穿刺培養，為高滲條件下發酵生產蛋白酶提供了一種可能的菌種。

參考文獻

[1] 劉國生.微生物學實驗技術[M].北京：科學出版社，2007.

[2] 代玉梅.蛋白酶高產菌株的篩選鑒定及酶學性質研究[D].青島大學，2008.

[3] 王永紅.產蛋白酶菌株的篩選、鑒定及水解菜粕蛋白能力[J].生物資源，2018，40（2）：135-140.

[4] 馬桂珍.高產蛋白酶細菌的分離篩選及其種類鑒定[J].食品科學，2011，32（21）：183-187.