HPLC法測定箭根薯中薯蕷皂苷元的含量

西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

箭根薯是傣醫常用藥之一，傣語稱咪火蛙，意譯為“味苦似牛膽”，為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯(TaccachantrieriAndre)的干燥塊莖(見圖1～2)。性味苦、涼，入水、風塔。具有清火解毒，消腫止痛，排膿生肌，止咳化痰功效。用于瘡瘍腫毒，痄腮，乳癰，咽喉腫痛、咳嗽痰多，脘腹疼痛，解食毒[1]。箭根薯是傣藥雅解片、西雙版納州傣醫院制劑“解毒養顏膠囊”、“健胃止痛膠囊”、“五寶膠囊”處方藥材之一。箭根薯含有薯蕷皂苷元、豆甾醇、胡蘿卜甙、根薯酮內酯類化合物[2-3]。據報道利用多種波譜技術從箭根薯的根及根莖中分離鑒定出10多個根薯酮內酯類化合物[4]。薯蕷皂苷元 (Diosgenin)又名薯蕷皂素，是薯蕷皂苷的水解產物[5-6 ]；該化合物具有溶血、降血脂、抗菌、消炎、抗腫瘤作用[7-11]。目前，箭根薯藥材的標準收載于《云南省中藥材標準》2005年版第一冊中，應用HPLC法對其中薯蕷皂苷元的含量測定并未見報道。參考文獻[12-15]采用了HPLC法對其中薯蕷皂苷的水解產物薯蕷皂苷元進行含量測定，建立箭根薯中薯蕷皂苷元含量測定方法，為箭根薯質量控制和質量標準的提升提供參考方法和依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀，T-214型電子天平(德國賽多利斯)，MS205DU型十萬分之一天平(梅特勒-托利多)。

1.2 材料 薯蕷皂苷元對照品(批號：111539-200001，中國食品藥品檢定研究院)使用前置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h后使用。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。箭根薯樣品采自西雙版納州景洪市和勐臘縣，經西雙版納州食品藥品檢驗所彭霞主任藥師鑒定為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯干燥塊莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：乙腈-水(90∶ 10)；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。理論塔板數按薯蕷皂苷元峰計算應不低于5000。薯蕷皂苷元峰與前后峰分離度應大于1.5。在此色譜條件下，薯蕷皂苷元對照溶液色譜圖和供試品溶液色譜圖如圖3～4所示。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置具塞錐形瓶中，蒸干，殘渣加3 mol/L鹽酸溶液25 mL使溶解，加熱回流1 h，取出，放至室溫，用石油醚(60～90℃)振搖提取4次，每次25 mL，合并石油醚(60～90℃)提取液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.3 方法學考察 按《中國藥典》2015年版四部“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”(通則9101)[16]的要求進行方法驗證。

2.3.1 線性關系考察 取濃度為671.6 μg/mL的對照品儲備液適量，加甲醇配制得53.70、100.6、144.2、263.0、671.6 μg/mL的對照品溶液，搖勻。按上述色譜條件分別進樣10 μL，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸。本品進樣量在0.5370～6.716 μg的范圍內線性良好，回歸方程為：Y=7.4659X-8.02026(r=0.9996)。

2.3.2 重復性試驗 取同一批次的供試品(批號：20130911)6份，分別按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照上述相同色譜條件測定，按干燥品計算，薯蕷皂苷元含量的RSD為1.2%(n=6)。

2.3.3 穩定性試驗 取同一批次的供試品溶液(批號：20130911)，在0、2、6、12、18、24 h進樣測定，測得薯蕷皂苷元峰面積的RSD為0.65%。結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(批號：20130911)約1.0 g，分別加入6個具塞錐形瓶中，分別加入對照品約3.9 mg，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果

2.3.5 樣品測定 按上述色譜條件測定，分別測定4個不同產地4批樣品，按干燥品計算含量，結果見表2。

表2 箭根薯中薯蕷皂苷元含量

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 用二極管陣列檢測器分析比較了薯蕷皂苷元對照品色譜峰和樣品所測成分相應色譜峰的紫外光譜。試驗證明，兩者的紫外光譜基本一致，均在203 nm處有一最大吸收峰，故選擇檢測波長為203 nm。

3.2 流動相的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同比例的甲醇-水、乙腈-水-冰醋酸溶液、乙腈-水作為流動相對測定結果的影響。結果表明，以乙腈-水溶液(90∶ 10)作為流動相，被測成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定乙腈-水溶液(90∶ 10)為該分析方法的流動相。

3.3 色譜拄溫度的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同色譜拄溫度(25℃、30℃、35℃)對測定結果的影響。結果表明，當色譜拄溫度35℃時被測成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定35℃為該分析方法的色譜柱溫度。

3.4 考察鹽酸濃度的選擇 取供試品(批號：20130911)，分別選用了2、3、4 mol/L鹽酸溶液進行水解，結果三者測定值分別為3.74、3.92、3.93 mg/g，取3 mol/L鹽酸溶液時，已經能水解完全，考慮到經濟成本，故選擇3 mol/L。

3.5 加熱回流提取時間考察 在其它條件不變的情況下，取供試品(批號：20130911)，分別進行了0.5、1、2 h回流提取，結果三者測定值分別為3.61、3.92、3.91 mg/g，說明1 h已基本提取完全，考慮到經濟和時間成本等因素，故選擇加熱回流提取時間為1 h。

3.6 水解時間考察 取供試品(批號：20130911)，選用了0.5、1.0、2.0 h進行水解，結果三者測定值分別為1.92、3.94、3.91 mg/g，說明1 h已基本水解完全，考慮到經濟和時間成本等因素，故選擇水解時間為1.0 h。

3.7 提取次數考察 取供試品(批號：20130911)，分別進行了3、4、5次提取，結果三者測定值分別為3.55、3.93、3.94 mg/g，說明4次已基本提取完全，考慮到經濟和人工成本等因素，故選擇提取次數為4次。

3.8 耐用性試驗 《中國藥典》2015年版四部“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”(通則9101)[16]，規范了中藥質量標準分析方法，為了進一步驗證“HPLC測定箭根薯中薯蕷皂苷元含量”方法的可靠性，筆者參照該指導原則以測定方法進行了驗證。為了給本方法用于常規檢驗提供依據，對其耐用性試驗進一步探討，考察了隨機變動因素對精密度的影響。考察了不同色譜柱：Agilent XDB-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；InertSustain C18 (5 μm, 250 mm×4.6 mm)；資生堂MGⅡ C18(5 μm,150 mm×4.6 mm)、不同檢測波長(201 nm、203 nm、205 nm)。結果基本一致，進一步確保了試驗方法的科學性及數據的準確性，為箭根薯質量標準的提高提供了科學依據。箭根薯的同屬植物裂果薯發現較好的抗癌活性[17-19]，目前對箭根薯研究報道較少，希望此研究為今后箭根薯的進一步研究、應用、開發提供參考。