環境污染物引起的內質網應激誘導神經系統損傷

(西北礦冶研究院 甘肅 白銀 730900)

一、前言

近幾十年來，隨著世界經濟的一體化發展，工業化規模也日趨龐大，大量人工合成的化學品釋放入環境。化學污染物通過飲用水、食物、土壤和大氣等環境介質與包括人類在內的環境生物體系全方位地接觸，成為本世紀初急需治理的“第三代污染”，其對生態環境和人類健康與生存可能帶來的潛在危害及其防治，成為新世紀的重大研究課題。經過大量研究發現，內質網應激在各種原因導致的機體損傷，如肝損傷，神經損傷中，占有十分重要的作用，其機制也得到越來越多的關注。

二、三氯乙烯簡介及研究進展

三氯乙烯(Trichloroethylene,PCE)是一種常見的重要的工業有機溶劑，為無色液體，有類似氯仿的嗅味，分子量131.4，沸點86.7℃，易溶于乙醇、乙醚等有機溶劑，不溶于水，具有較強的脫脂作用，可用做金屬脫脂劑、萃取劑、干洗劑、溶劑等，廣泛應用于五金、電子、玩具、印刷等行業。在工業生產和使用過程中三氯乙烯可以通過呼吸道、消化道和皮膚吸收，由于作業人員通常是手工作業，致使皮膚直接接觸吸收在三氯乙烯的致病中具有非常重要的意義。

三、污染物對生物的影響

污染物通過多種途徑進入生物機體后，一部分經代謝排出體外，而有些污染物或污染物的代謝產物會對生物產生毒性作用。已有研究表明，污染物對生物機體的影響首先作用于生物大分子，在不同水平(器官、細胞、分子等)上引發各種各樣的毒性效應。隨著對毒物危害機體的本質逐步深入研究，目前有關化學物質的毒作用機制主要包括：自由基與氧化損傷，外源性化合物共價結合，細胞鈣穩態紊亂等。

四、氧化損傷在神經毒性中的作用

自由基氧化損傷是多種神經功能紊亂以及腦功能紊亂的病理學原因之一，同時也和神經細胞凋亡、炎癥反應的發生密切相關。在正常情況下，體內氧自由基的產生和清除是平衡的。當自由基的產生過多或體內抗氧化系統出現故障，體內氧自由基代謝就會出現失衡，自由基蓄積過多攻擊機體，即為氧化應激。

氧化應激不但可以直接損傷細胞，導致細胞壞死，它還可以通過介導線粒體途徑、DNA修復酶及轉錄因子等間接導致細胞凋亡。

五、紫甘薯花青素簡介及研究進展

紫甘薯花青素(Purple Sweet Potato Color,PSPC)是紫色甘薯(Ipomoea.Batatas Lam.)中提取的黃酮類化合物，其具有抗氧化和消除自由基、降低血清和肝臟中脂肪含量、抗突變、抗腫瘤、防止人體內過氧化、提高視力等作用，紅色至紫紅色的粉狀物、糊狀物或液體，易溶于水、乙醇和丙酮等，不溶于石油醚等有機溶劑。因其吡喃環上有酚羥基以及四價氧原子，所以其同時具有酸和堿的性質，對酸堿十分敏感，其色調和穩定性易受PH值影響。己有實驗證明PSPC具有抗衰老，抗輻射損傷，抗腫瘤等多種生物活性。本實驗依據PSPC降低炎癥的作用來研究PSPC對PCE誘導的內質網應激引起的神經系統損傷是否具有保護作用，具有一定的醫學和社會意義。

六、材料與方法

(一)實驗動物分組及處理

8周齡雄性C57 BL/6J小鼠40只，體重為22.43±3.23g，動物購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗開始前，動物被飼養在室溫為23 1℃，濕度是60%房間里。小鼠被隨機分為4組每組10只，12小時有光/12小時黑暗(光照8：30-20：30)，小鼠可以自由飲水和進食。在小鼠適應實驗室條件后，隨機分為四組的小鼠收到不同的食物和飲水，分別為：(1)對照組；(2)PCE組；(3)PCE+PSPC組；(4)PSPC組。分別灌喂2000mg/kg/d的PCE，PCE+PSPC，PSPC，連續處理三周。進行行為學實驗。所有的實驗動物的管理和處理按照中國實驗動物管理的法規執行。

(二)藥品與儀器

三氯乙烯(PCE)、紫甘薯花青素(PSPC)

LEICA CM1900恒冷切片機

LEICA SP5雙光子激光共聚焦

Biofuge primoR高速冷凍離心機(Heraeus)

高速冷凍離心機(德國Eppendorf生產，型號為5810R)

ABI 2400 PCR儀

Bio-Rad凝膠成像分析儀

DYY-10型ECP300三恒電泳儀(北京市六一儀器廠)

DYCZP 40B型電泳槽(北京市六一儀器廠)

WD一9412A型恒溫循環器(北京市六一儀器廠)

WD-9405型水平搖床(北京市六一儀器廠沃德生物醫學儀器分廠)

MP200A電子天平

電動勻漿器(聯邦德國Braun廠產品，型號為Potter-Elvehjem Tissue Grinders-1020259)

(三)組織樣品處理

最后一次灌喂PCE 24小時后，將小鼠用乙醚深度麻醉，處死，迅速取出腦組織，放于1/10(w/v)PBS(含蛋白酶抑制劑)中放于冰上勻漿后，5000×g，4℃，離心15min。收集上清液，放于-70℃儲藏，用于生化指標的測定。

七、ROS的測定

(一)測定方法及原理

我們采用DCF二氯熒光法對小鼠大腦細胞內產生的ROS進行監測，通過分析氯甲基二氫熒光素乙酯(CM-H2DCFDA)熒光探針最后產生的熒光密度而得出最終數值。CM-H2DCFDA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成H2DCF，而H2DCF不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的H2DCF生成強熒光的二氯熒光素DCF。通過檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

(二)操作方法

分離后的腦細胞組織液加入10μM二氯熒光乙酰乙酸鹽H2DCFDA于37℃孵育30min，用KHB緩沖液沖洗細胞三次洗掉多余染料后，用酶標儀在激發波長480nm，發射波長530nm條件下測定熒光密度值。沒有用染料處理的細胞用來檢測背景熒光值以去除本底干擾，最終熒光密度通過Bradford法對蛋白質濃度的測定來進行標準化。

八、藥物對機體內ROS的影響

CTLPCEPCE+PSPCPSPCROS(pmolDCF formed/min/mg protein)2.57.63.12.4SD0.140.920.220.18

圖1藥物對ROS的影響

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是外源性氧化劑或細胞內有氧代謝過程中產生的具有很高生物活性的氧分子，如O2-，·OH和脂質過氧化物等。在特定條件下，低水平的氧自由基能誘導細胞凋亡，而活性氧被認為在細胞凋亡過程中廣泛存在。

從圖1可以看出，用PCE染毒時，與對照組所測得的值相比，導致小鼠體內ROS的含量迅速上升，且為最高，其值為7.6。用PCE和PSPC聯合作用時，發現ROS的水平又有了大幅度的下降，下降至3.1，與對照組相比，還是要高于對照組。用PSPC染毒作用時，測得ROS值為2.4，與對照組相差無幾，基本視為無變化。

結語

在這個模型里，PCE可以導致機體內ROS含量升高，PSPC可以有效抑制PCE對神經系統的損傷，減少ROS的值。表明PSPC能夠減弱PCE誘導內質網應激引起的神經系統損傷。