MiR-101對胃癌化療耐藥的影響及機制

雷子穎 唐鴻生(通訊作者) 阮強 王佳泓 王進 黃永紅

510095廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腹部綜合外科

胃癌是消化道中最常見的惡性腫瘤之一，其重要的生物學特征之一就是侵襲和轉移，亦是胃癌患者死亡的主要原因。雖然隨著臨床診斷與治療水平的提高，胃癌的治療與診斷水平有了明顯的提高，但是其惡性度高、易轉移仍是導致胃癌患者死亡率高的重要原因。目前對于胃癌的治療仍以手術為主，但尚有一部分患者因體質或胃癌分期較晚而無法選擇手術，化療是替代手術治療的一種方法[1]。但部分患者存在對化療藥物無效及耐藥的情況。miR-101 是近年來發現的一種對于腫瘤化療耐藥過程起作用的微小RNA，在多種惡性腫瘤中發揮類似抑癌基因作用，為探究其對胃癌化療耐藥的影響，特進行本次研究。

資料與方法

材料：本次研究所用到的主要試劑與材料是人正常胃黏膜上皮細胞GES1、人胃癌SGC7901 細胞系、胃癌耐藥SGC7901細胞系(DDP細胞系)、特級新生小牛血清、實時熒光定量PCR 儀、細胞裂解液、TRIzolRNA 抽提試劑盒等。其來源統計，見表1。

方法：①細胞培養：采用人正常胃黏膜上皮細胞GES1、人胃癌SGC7901 細胞系、DDP 細胞系，細胞株培養在含有10%胎牛血清以及含1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 細胞培養液中。細胞培養箱條件37℃，含有5%CO2。以下所有實驗用細胞均取對數生長期細胞。②實時熒光定量PCR：用RNA 提取試劑盒提取細胞的總RNA，隨后按照說明書進行逆轉錄。引物序列來自于南京建成生物工程公司。miR-101的序列為上游引物5'-GGCTCTGAGT- GGTTGAGC-3'、下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；cmet的引物序列為上游引物5'-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3'、下游引物5'-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3'擴增條件按照說明書設置。其后對擴增產物進行檢測，計算3組細胞系的相對表達量。③細胞轉染：轉染前1 d 以1×106/mL 接種生長至對數期的胃癌SGC7901細胞于6孔板，轉染前先對細胞系進行饑餓處理1 h，并配備轉染溶液(無血清培養基、轉染試劑、質粒)并置于37℃溫育15 min。將配置好的轉染溶液緩慢滴注到6 孔板內，輕晃孔板后置于37℃溫育5 h；祛除轉染液后，繼續將細胞培育于DMEM 液體培養基，孵育條件為5%體積分數的二氧化碳、37℃飽和濕度。比較轉染前后DDP細胞的c-met的相對表達量。

表1 實驗材料及來源統計表

統計學方法：本次研究所有數據，均采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，計量資料采用t檢驗，計數比較χ2檢驗，檢驗標準α=0.05，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

3 組 細 胞 系 的miR-101、c-met 的mRNA 表達情況：3 組細胞系的miR-101、c-met 的mRNA 相對表達量統計，見表2。

轉染miR-101 及其抑制劑對胃癌SGC7901 細胞c-met 的表達影響：轉染miR-101 前、轉染miR-101 后及轉染miR-101 抑制劑后c-met 的相對表達量，見圖1。

討 論

胃癌是消化道中最常見的惡性腫瘤之一，其占據農村癌癥發病率的首位。胃癌惡性程度高，印戒細胞癌惡性程度尤其高，胃癌的侵襲和轉移能力強，遠隔臟器或組織的轉移是導致胃癌患者死亡的最主要的原因。目前對于胃癌瘤體較大、患者基礎體質差而不能耐受手術或患者不愿手術治療的患者，多采取化療的治療方式。但在某些患者卻存在對化療藥物耐受的現象，及對其他普通患者有效的化療方案，卻對這些患者的腫瘤不起作用。

表2 3組細胞系的miR-101、c-met的mRNA相對表達量統計表(±s)

表2 3組細胞系的miR-101、c-met的mRNA相對表達量統計表(±s)

細胞 miR-101 c-met GES1細胞 1.11±0.04? 1.12±0.08#胃癌SGC7901細胞 0.62±0.04 1.57±0.10 DDP細胞 0.35±0.03 2.89±0.32注：GES1細胞的miR-101表達量與胃癌SGC7901細胞、DDP細胞相比，?P＜0.05，其中與DDP 細胞相比，P＜0.01；表示GES1 細胞的c-met 表達量與胃癌SGC7901 細胞、DDP 細胞相比，#P＜0.05，其中與DDP細胞相比，P＜0.01。

圖1 轉染miR-101及其抑制劑對胃癌SGC7901細胞c-met的表達影響

近年來的研究發現，miRNA 作為無編碼的短小核苷酸鏈在機體內能起到調控基因含量與表達的作用；王莉莉通過RT-qPCR對口腔鱗癌病理組織中的miR-188 表達量分析發現[2]，miR-188 在口腔鱗癌組織中表達量顯著下降。而其他一些miRNA 在腫瘤中的作用也相繼被揭示開來。miR-101 是近年發現的一個腫瘤抑制miRNA，在多種惡性腫瘤組織中表達下調，在腫瘤發生、發展過程中具有類似抑癌基因作用。Guo等人對卵巢癌進行轉染miR-101(miR-101 mimic)時發現[3]，轉染后的卵巢癌細胞其穿膜細胞數及細胞增殖率明顯減低，這提示miR-101 在對卵巢癌的增殖及轉移方面起著較好的抑制作用。同時，孫海兵等人通過對比正常人與胃癌患者、胃癌化療耐藥患者的血清miR-101時發現[4]，胃癌患者的血清miR-101 明顯低于正常人，而胃癌化療耐藥患者更低。Tian等報道，替莫唑胺耐藥的膠質瘤細胞miR-101 表達下調[5]，過表達miR-101可通過抑制糖原合成酶激酶3β 逆轉替莫唑胺的耐藥性。c-met是一種耐藥性基因，其耐藥機制主要可能與PI3K信號通路相關聯，研究表明抑制c-met表達可通過阻斷PI3K/Akt通路，增強胃癌對順鉑的敏感性[6]。

在本次研究中發現，與正常胃黏膜細胞相比，SGC7901 細胞系、DDP 細胞系的miR-101的表達水平降低，而c-met表達水平升高，以DDP 細胞系更顯著(P＜0.01)。隨 后 筆 者 采 用miR-101 對SGC7901 細胞系進行轉染處理，轉染處理后SGC7901 細胞系的c-met 表達水平隨之降低，再對這些細胞進行miR-101抑制劑處理，結果c-met 表達水平升高，且高于正常的SGC7901細胞系。

綜上所述，miR-101 在人胃癌細胞中表達水平降低，而耐藥性胃癌細胞表達水平更低，其低水平表達能降低對耐藥相關基因c-met 表達的抑制而促使胃癌細胞對化療耐藥。