TIAM1蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

聶紅艷，邱艷麗，靳 燕，曹嫣娜，閆 杰，李 杰，王景福，趙 強(qiáng)

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院兒童腫瘤科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移蛋白（T-lymphoma invasion and metastasis 1，TIAM1）基因，即 TIAM1 基因，是一種鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子（GEF），為Rho家族中Rac1特異激活劑，參與細(xì)胞骨架活動(dòng)，以及細(xì)胞遷移、粘附和侵襲、癌變和轉(zhuǎn)移等[1]。有文獻(xiàn)表明，TIAM1促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，例如：在食管癌[2]，肝癌[3],宮頸癌[4]，甲狀腺癌[5]等疾病中。而在結(jié)直腸癌中，有研究者提出其具有抑癌的作用[6]。有學(xué)者對(duì)106例原發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織進(jìn)行二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，具有TIAM1基因變異者，其預(yù)后更好。認(rèn)為可將TIAM抑制劑與常規(guī)療法相聯(lián)合，來(lái)改善患者預(yù)后[7]。然而，Cao等[8]對(duì)33例神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma,NB）組織進(jìn)行靶向捕獲的二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)1例TIAM1基因缺失，該患者組織經(jīng)HE染色為NB分化差型。因此，TIAM1是促進(jìn)NB發(fā)生和轉(zhuǎn)移還是具有抗癌作用，仍需進(jìn)一步探索。本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)NB組織中TIAM1的表達(dá)，探討其是否與NB的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2010-2015年就診于我院病理診斷明確、腫瘤標(biāo)本保存完好、治療規(guī)律，隨訪資料完整的病例61例，其中節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤9例，NB52例。根據(jù)INSS分期標(biāo)準(zhǔn)，NB的例數(shù)為：1期9例，2期6例，3期12例，4期24例，4S期1例。定義1、2及4S期為低分期（低危組）15例，3、4期為高分期（中-高危組）37例。年齡大于18個(gè)月者35例，小于18個(gè)月者17例；起源于頸、腹部者38例，胸、盆腔者14例；初治時(shí)腫瘤大小≤6 cm者26例，＞6 cm者26例；低分化者31例，高分化者21例。采用門診、電話隨訪，統(tǒng)計(jì)終點(diǎn)為復(fù)發(fā)，死亡或隨訪終點(diǎn)，末次隨訪時(shí)間為2017年9月1日，隨訪時(shí)間為4～74個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為33個(gè)月，截至隨訪結(jié)束時(shí)，死亡6例。

1.2 免疫組化染色 免疫組化通用試劑盒PV-6000操作說(shuō)明進(jìn)行，簡(jiǎn)要步驟如下：切片脫蠟水化；枸櫞酸抗原修復(fù)；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10min；滴加TIAM1一抗（abcam），4℃過(guò)夜，室溫復(fù)溫后，滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG復(fù)合物，37℃，20 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精返紅、氨水返藍(lán)，脫水、透明、封片。

1.3 結(jié)果判讀 對(duì)上述61例患者石蠟切片進(jìn)行TIAM1免疫組化染色，至少2名專業(yè)兒童病理科醫(yī)師，采用半定量分級(jí)法評(píng)分對(duì)染色結(jié)果做出判斷，根據(jù)呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞所占比例和反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色顆粒。采用雙盲法，用染色強(qiáng)度和同樣物鏡視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)乘積作為評(píng)分；染色強(qiáng)度分為四個(gè)等級(jí)：0分=無(wú)色；1分=淺黃色；2分=棕黃色；3分=棕褐色；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分四個(gè)等級(jí)為：1分=1%～10%；2分=11%～50%；3分=51%～75%；4分=76%～100%，兩者的乘積作為評(píng)分?jǐn)?shù)值，定義評(píng)分小于等于4分為低表達(dá)，評(píng)分大于4分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Log-rank χ2檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，Kaplan-Meier法分析患者生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。“*”代表P＜0.05,“**”代表P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 TIAM1在腫瘤組織中的表達(dá) 在NB組織中，TIAM1弱表達(dá)（評(píng)分≤4）16例，TIAM1強(qiáng)表達(dá)（評(píng)分＞4）36例。而在這9例節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤中8例為高表達(dá)，1例為低表達(dá)，陽(yáng)性率為88.9%。TIAM1蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，但也可表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)[6]（圖1），并且其表達(dá)與NB分化程度相關(guān)（χ2=4.493，P=0.034），分化程度越高的組織其表達(dá)越強(qiáng)。TIAM1 與年齡 （χ2=0.243，P=0.622），發(fā)病部位（χ2=0.043，P=0.835），初治時(shí)腫瘤大小（χ2=1.444，P=0.229），INSS 分期（χ2=0.843，P=0.358），危險(xiǎn)度分組（χ2=1.926，P=0.165），轉(zhuǎn)移（χ2=2.066，P=0.151），LDH 水平（χ2=0.222，P=0.638）無(wú)關(guān)（表 1）。

表1 TIAM1蛋白表達(dá)與NB患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系Tab 1 Relationship between the expression of TIAM1 protein and the clinical characteristics of patients with neuroblastoma

圖1 免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中TIAM1表達(dá)情況（IHC×200）Fig 1 The expression of TIAM1 in neuroblastoma（IHC×200）

2.2 生存分析 見(jiàn)圖2。

圖2 NB患者TIAM1陰性表達(dá)和陽(yáng)性表達(dá)生存分析Fig 2 Survival analysis ofnegative and positive expression in TIAM1 in NB patients

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤，全基因組相關(guān)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)，NB是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，其形成與等位基因的多態(tài)性相關(guān)，包括MYCN擴(kuò)增、ALK突變，LIN28B基因多態(tài)性，ATRX基因組重排等[9]。而與NB發(fā)生或預(yù)后密切相關(guān)的基因，主要仍是MYCN擴(kuò)增以及ALK突變[10]。研究表明，Aurora-A對(duì)MYCN蛋白表達(dá)具有促進(jìn)作用[11],其過(guò)表達(dá)與預(yù)后不良神經(jīng)母細(xì)胞瘤密切相關(guān)[12]。但對(duì)于Aurora-A抑制劑的研究現(xiàn)今主要仍在動(dòng)物模型中，例如，有學(xué)者證實(shí)：在N-MYCN擴(kuò)增的小鼠模型中，MLN8054和MLN8237這兩種Aurora-A抑制劑，能促進(jìn)腫瘤消退和延長(zhǎng)小鼠生存期[13-14]。另一方面，克唑替尼作為ALK基因突變靶向藥物在非小細(xì)胞肺癌得到廣泛運(yùn)用并取得顯著療效，但由于NB中存在ALK激活點(diǎn)突變，使其對(duì)克唑替尼存在敏感性差異，甚至于ALK中某些點(diǎn)突變會(huì)對(duì)其產(chǎn)生內(nèi)源性耐藥[15]。并且，MYCN擴(kuò)增型約占NB的18%～38%，ALK突變主要存在于家族性神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中[11，16]。因此，NB的治療遇到瓶頸，需要發(fā)現(xiàn)新的基因、新的有效治療手段來(lái)解決這一難題。

在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，軸突生長(zhǎng)是通過(guò)生長(zhǎng)錐的延伸和遷移而發(fā)生的，而TIAM1正向調(diào)控生長(zhǎng)錐中層脂膜和絲狀偽足[17]，并且可通過(guò)激活Rac1、抑制Rho-GTP酶（Rac1促進(jìn)軸突生長(zhǎng),而Rho激活導(dǎo)致突起回縮），影響軸突形成，促進(jìn)神經(jīng)元分化[18]。研究證實(shí)：TIAM1參與星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的極化生長(zhǎng)，其缺失導(dǎo)致突起中微管細(xì)胞骨架紊亂[19]。同時(shí)，TIAM1不僅參與Reelin蛋白介導(dǎo)的施旺細(xì)胞的遷移[20]，還與多巴胺能神經(jīng)元的分化和發(fā)育相關(guān)[21]。因此，可以得出TIAM1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤來(lái)源于原始神經(jīng)嵴細(xì)胞，主要是因神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和施旺細(xì)胞障礙，產(chǎn)生了其他未成熟的神經(jīng)元細(xì)胞（神經(jīng)母細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)母細(xì)胞）而導(dǎo)致NB的發(fā)生[22]。同時(shí)，NB是一種常見(jiàn)的具有自發(fā)性消退趨勢(shì)的疾病，這種自發(fā)性消退與分化主要存在于低危患者以及4S期患者中[23]。研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA在低危型及4S期NB中呈高表達(dá)狀態(tài)，且當(dāng)腫瘤微環(huán)境存在NGF（神經(jīng)生長(zhǎng)因子）時(shí)，其可引起NB分化[24]。此外，TrkA還可增強(qiáng)由Ras介導(dǎo)的細(xì)胞變性所引起的NB自我消退效應(yīng)[25]。

TrkA能促進(jìn)Rac1活化使TIAM1活性增強(qiáng)。而TIAM1與Ras協(xié)同作用能介導(dǎo)NGF誘導(dǎo)的RAC1活化，產(chǎn)生RAC1依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致突起生長(zhǎng)所需的細(xì)胞骨架重塑。因此，TIAM1可作為NGF依賴性突起生長(zhǎng)的信號(hào)介導(dǎo)因子[26]。Trk受體可激活Ras-GTP酶，使其在神經(jīng)元存活和分化中起關(guān)鍵作用。其中，TrkC受體酪氨酸激酶作用于NT3（神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3），激活Rac1和cdc42促進(jìn)施旺細(xì)胞遷移，而TIAM1為其中的關(guān)鍵介質(zhì)[27]。綜上所述，可以看出TIAM1在神經(jīng)分化中具有重要作用，而這種作用極可能通過(guò)TrkA/Ras/Tiam1/Rac1這條通路實(shí)現(xiàn)。TrkA、Ras對(duì)NB分化起促進(jìn)作用，因此，TIAM1作為Ras的下游效應(yīng)分子以及Rac/Rho通路的調(diào)節(jié)者，其可能在NB分化中具有重要作用。

上述免疫組化驗(yàn)證了TIAM1與NB分化相關(guān)，且分化程度越高的組織表達(dá)越強(qiáng)（圖1）。因此，可以推斷出TIAM1參與并促進(jìn)NB的分化，可以作為NB治療的潛在靶點(diǎn)。但通過(guò)對(duì)這52例樣本進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，TIAM1蛋白高表達(dá)與患者3年生存率無(wú)明顯相關(guān)性（圖2），這可能與樣本量少有關(guān)，下一步需擴(kuò)大樣本量并進(jìn)一步探討TIAM1在NB分化中的作用并了解其是否能成為NB潛在治療靶點(diǎn)。