MiR-145-5p對膠原誘導的關節炎小鼠關節炎癥的影響

明建松 ，王曉雪 ，楊夢晨 ，湯 可 ，袁玉華

（1.天津醫科大學總醫院檢驗科，天津300052；2.天津港口醫院檢驗科，天津300456）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性并累及多個關節的自身免疫性疾病，它的發病機理是一種涉及到多種細胞、細胞因子和免疫活性物質的復雜過程，其發病機制尚不完全清楚。近幾年發現microRNA參與免疫應答反應，可能在RA的疾病進展中發揮重要作用。前期實驗發現，miR-145-5p在RA中與對照組骨關節炎（OA）滑膜組織和滑膜細胞相比，在RA外周血單個核細胞（PBMC）、滑膜組織和成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）中miR-145-5p水平顯著增加[1]。通過調節ADAM17的表達，miR-145-5p調節RA-FLS的增殖、細胞周期進程和炎性細胞因子的表達；通過下調Ets-1，miR-145-5p模擬上調IL-17水平和基質金屬蛋白酶MMP-3，MMP-9和MMP-13的表達。現結合膠原誘導的關節炎CIA小鼠模型，增強miR-145-5p表達，觀察CIA小鼠關節變化情況，分析miR-145-5p在CIA中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 DBA/1小鼠36只，雄性，8周齡左右，SPF（Specefic Pathogen Free，無特定病原體）級，體質量（20±2）g，由北京華阜康公司提供，標準飼料喂養，自由飲水、飲食，適應性飼養7 d，進行實驗。動物于天津醫科大學總醫院飼養。本研究經天津醫科大學動物護理與使用委員會批準。

1.2 試劑 牛Ⅱ型膠原（液）及弗氏完全佐劑購于美國chondrex公司，agomiR-145-5p購于中國廣東Ribobio公司，小鼠麻醉劑水合氯醛購于美國sigma公司。將凍干的牛II型膠原蛋白在4℃下在0.05 mol/L乙酸中過夜溶解，在弗氏完全佐劑中乳化至最終濃度為2 mg/mL。

1.3 CIA小鼠模型建立 取36只8周齡，雄性DBA/1小鼠，適應性飼養2～3 d之后，隨機分組選出10只小鼠作為miRNA陰性對照（miR-NC）組，其余作為模型構建組，進行初次免疫。按照每只100 μL牛Ⅱ型膠原進行根部皮下注射，注射部位為距尾根部2 cm至0.5 cm區間，miR-NC組按同樣方法注射等體積的生理鹽水。初次免疫21 d后，進行加強免疫，模型構建組每只小鼠腹腔注射100 μL牛Ⅱ型膠原，miR-NC組同樣方法注射等體積生理鹽水。

1.4 成模小鼠免疫及分組給藥 加強免疫后，每天觀察記錄小鼠精神狀態及關節腫脹情況，篩選出發病時間相近的關節炎指數大于4分的發病小鼠20只，隨機分為agomiR-145-5p組及agomiR空載體（agomiR-NC）組，每組10只，在初次免疫后第30天將等體積的agomiR-145-5p和agomiR-NC進行鼠尾靜脈注射，之后每隔3 d注射1次，共進行3周。

1.5 關節評分觀察及CIA小鼠足跖腫脹程度比較 加強免疫后，隔天觀察誘導小鼠關節腫脹情況；于小鼠分組治療后，每天進行關節炎評分，記錄關節炎指數（AI），相加得總評分[2]。

1.6 micro-CT掃描 小鼠膝關節和踝關節在固定后進行micro-CT掃描重建。

1.7 病理分析及免疫組化檢測 用10%水合氯醛（0.04 mL/10 g）麻醉小鼠后，處死所有小鼠。取小鼠踝關節進行固定、脫水、透明，并用石蠟包埋切片，進行HE染色，鏡下觀察小鼠關節病變情況。通過對小鼠踝關節組織切片進行免疫組化染色，檢測MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、IL-17和 ADAM17 的表達。

1.8 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用±s表示，采用配對樣本t檢驗進行分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 模型建立及關節炎評分指數變化情況 對DBA/1建模，約85%小鼠成功建立CIA模型，足部出現關節炎癥狀。對小鼠四肢進行評分記和。與agomiR-NC組比較，agomiR-145-5p組的小鼠在給藥后第4天關節炎評分指數開始相對下降（P＜0.05）（圖 1）。

2.2 小鼠足部變化 miR-NC組小鼠足部呈正常粉紅色，足掌、踝、掌指及指關節均無腫脹。發病小鼠足掌增厚、多關節紅腫，行走不便，急性期受累足不能負重。膠原誘導成功小鼠足厚度、足體積較miR-NC組小鼠高。agomiR-145-5p治療后部分減輕了小鼠足部的腫脹和發紅（圖2）。

圖1 CIA小鼠的關節炎評分Fig 1 Arthritis scores for CIA mice

圖2 注射前后CIA小鼠的后爪Fig 2 Hind paws of CIA mice before and after injection

2.3 HE染色觀察miR-145-5p對CIA小鼠關節軟骨損傷的治療效果 HE染色結果如圖3所示，與miR-NC組比較，agomiR-145-5p組小鼠膝關節滑膜組織明顯增生肥厚，滑膜周圍結締組織中有大量淋巴細胞和少量中性粒細胞浸潤，有豐富的血管翳形成，關節軟骨及軟骨下骨侵蝕破壞嚴重。與agomiR-NC組比較，agomiR-145-5p組滑膜增生顯著降低，骨破壞顯著增強（P＜0.05）（圖 4）。

圖3 來自CIA小鼠后爪切片的HE染色Fig 3 Hematoxylin and eosin staining of sections from the hind paws of CIA mice

圖4 CIA小鼠的組織病理學評分Fig 4 Histopathological scores of CIA mice

2.4 micro-CT掃描評價miR-145-5p治療對CIA小鼠關節損傷的影響 與miR-NC組比較，agomiR-145-5p組與agomiR-NC組都表現出踝關節的骨侵蝕；與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組骨侵蝕更嚴重（圖5）。

圖5 骨破壞的比較Fig 5 Comparison of bone destruction

2.5 免疫組化檢測 與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組小鼠的后踝中MMP-3，MMP-9，MMP-13和IL-17蛋白水平增加，MMP-1水平沒有差異，ADAM17蛋白減少（圖6）。

圖6 CIA小鼠的MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，IL-17和ADAM17的免疫組化檢測Fig 6 Immunohistochemistry （IHC）and quantification of MMP-1,MMP-3,MMP-9,MMP-13,IL-17,and ADAM17in CIA mice

3 討論

為進一步明確miR-145-5p在RA關節軟骨損傷中的作用，本實驗選用造模成功率高的DBA/1小鼠，通過II型膠原和完全弗氏佐劑混合尾根部皮下注射的方法制備CIA小鼠模型，初次免疫后4周，小鼠出現足爪紅腫、活動受限等RA相關癥狀，由此可見本實驗所建立的CIA模型是成功的。通過關節評分、micro-CT分析、病理分析及免疫組化檢測等相關實驗發現miR-145-5p加重關節破壞的同時部分抑制了CIA小鼠的關節炎癥，同時發現與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組小鼠的后踝中 MMP-3，MMP-9，MMP-13 和 IL-17 蛋白水平升高，MMP-1水平沒有差異，ADAM17蛋白水平降低。

ADAM17是一種TNF-轉換酶，被鑒定為切割TNF-α前結構域的酶，并且被認為是在炎癥反應期間負責釋放TNF-α的主要蛋白酶[3]。另外，據報道ADAM17通過激活EGFR/PI3K/AKT途徑促進神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲[4]。本實驗相關實驗的結果證實ADAM17促進FLS增殖并且還表明ADAM17減少RA-FLS中的TNF-α產生。此外，敲減ADAM17減少TNF-α產生并增加miR-145-5p以及IL-17和MMPs的表達，這可能表現為miR-145/ADAM17/TNF-α的反饋環。據報道，FLT1，TLR4，TGFB2和APRIL分別與炎癥反應有關，涉及RA中的細胞增殖、細胞周期、炎性細胞浸潤和血管生成[5-8]。今后需要進一步研究miR-145-5p是否可以 直 接 降 低 ADAM17，FLT1，TLR4，TGFB2 和APRIL的表達，從而抑制炎癥反應。

IL-17主要由Th17細胞釋放，Th17細胞是一種特殊類型的人類輔助性T細胞[9]。這種細胞因子在炎癥和包括RA在內的自身免疫性疾病的發展中起著至關重要的作用[10]。研究表明，IL-17誘導RA中MMP-3，MMP-9和MMP-13的產生[11-12]。眾所周知，RA患者的骨和軟骨破壞部分由MMP活化的滑膜細胞和軟骨細胞構成[13]。此外，Ets-1被報道為Th17分化的負調節因子。miR-145過表達導致RA-FLS中IL-17，MMP-3，MMP-9 和 MMP-13 水平升高與Ets-1水平降低的相關性，以及RA-FLS中Ets-1調節IL-17的機制仍需進一步深入研究。

即使CIA小鼠模型中關節炎癥被部分抑制，施用miR-145-5p也會加重骨破壞，說明miR-145-5p可能調節多種信號通路，例如miR-146a和miR-155與炎癥反應和RA疾病呈正相關，但在關節破壞中起負面作用[14-15]。這項研究證實了RA中miR-145-5p介導的基因調節的復雜性，為后續研究提供了參考。