Lucy-tag促進海七鰓鰻嗅覺受體細胞膜表達

高 翔，張 哲，李偉明，任建峰，祖 堯，張慶華

(上海海洋大學1. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室、2. 海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心、3. 國家水生動物病原庫，上海 201306；4. 密歇根州立大學漁業(yè)與野生生物系，美國密歇根 東蘭辛 48824)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)是一類重要的細胞表面7次跨膜受體超家族，能夠轉(zhuǎn)導激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子以及光線等物理、化學的細胞外信號[1]。全世界目前有將近1/3的GPCR小分子藥物作為其拮抗劑和激活劑，因此，GPCR是優(yōu)異的腫瘤藥物作用靶點[2]?；?個跨膜結(jié)構(gòu)域不同層次的同源性，GPCR成員可分4類：視紫紅質(zhì)類(Rhodopsin)(A類)、分泌素和黏素(Mucin)類(B類)、代謝型谷氨酸(Metabolic glutamate)類(C類)，以及卷曲型/苦味嗅覺受體TAS2(bitter taste receptor 2)類[3]。視紫紅質(zhì)受體家族是 GPCR 超家族中最大的家族[4]。在脊椎動物中，GPCR配體類型非常廣泛，包括多肽、胺、嘌呤等。該家族可被進一步分為 α、β、γ 和 δ 亞類[5]，視紫紅質(zhì)δ 類中的嗅覺受體包括388個受體。根據(jù)編碼嗅覺受體基因的結(jié)構(gòu)不同[6]，在進化關(guān)系上嗅覺受體被分為5個彼此獨立的家族：主嗅覺受體(main olfactory receptors，MORs)[7]、犁鼻器Ⅰ型受體(vomeronasal type-1 receptors，V1Rs) 、犁鼻器Ⅱ型受體(vomeronasal type-2 receptors，V2Rs)[8]、痕量胺相關(guān)受體(trace amine-associated receptors，TAARs)[9]以及甲酰基肽受體(formyl peptide receptors， FPRs)[10]。

嗅覺受體(olfactory receptor，OR)基因首先由Buck等[7]在褐家鼠(Rattusnorvegicus) 中分離得到。由于海七鰓鰻具有已知的脊椎動物最小的嗅覺受體家族，包括27個ORs、28個TAARs和4個V1Rs[11]，因此，成為研究嗅覺受體與配體關(guān)系及作用機制的良好模型。本研究通過對海七鰓鰻的嗅覺受體的N端加以Rho-tag及Lucy-tag修飾，檢測其在HEK293T細胞膜表面表達，并驗證了Lucy-tag不影響海七鰓鰻嗅覺受體的固有活性，也不影響GPCR的IP3信號轉(zhuǎn)導，為進一步探究嗅覺受體蛋白的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為GPCR的膜表達提供了有利的方法，并為充分利用海七鰓鰻具有已知最小的嗅覺受體家族這個優(yōu)勢，系統(tǒng)分析嗅覺受體識別配體的規(guī)律提供基礎(chǔ)，為哺乳類受體的功能研究提供可借鑒的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 HEK293T細胞系，由海軍軍醫(yī)大學醫(yī)學免疫學國家重點實驗室曹雪濤教授惠贈。

1.1.2試劑 分子克隆T載體pMD19-T載體(6013)，購自TaKaRa公司；哺乳動物細胞系表達載體pCMV-Tag-2b (211172)，購自Agilent Technologies公司；小鼠受體轉(zhuǎn)運蛋白重組表達載體pCI-mRTP1s、小鼠嗅覺型G蛋白α亞基重組表達載體pCI-Gαolf，由美國杜克大學H. Matsunami教授饋贈；螢火蟲熒光素酶報告基因載體CRE-Luciferase vector pGL4.29(E847A)，購自Promega公司；加強型綠色熒光蛋白重組表達載體pEGFP-N1(6085-1)，購自Clontech公司。20種海七鰓鰻的嗅覺受體基因中，主嗅覺受體有1681.OR230、275288.OR230、13499.OR262、7812.OR322、922.OR354、3267.OR361、3267.OR408、107483.OR345-1、107483.OR345-2、107483.OR345-3、GL476599.fa_247108_248121-R、GL478569.fa_174252_175250、GL480420.fa_10877_11839；犁鼻器Ⅰ型受體有2061.V1R320；痕量胺相關(guān)受體有2594.TAAR340、7446.TAAR346a、7446.TAAR346b、14718.TAAR353、22166.TAAR354、 GL486090.fa_3064_4137。20個嗅覺受體由本實驗室克隆，只在N端修飾Rho-tag時，不能膜表達的嗅覺受體有7個，分別為13499.OR262、GL476599.fa_247108_248121-R、1681.OR230、7446.TAAR346b、3267.OR408、GL478569.fa_174252_175250、2594.TAAR340；低表達(表達率<10%)的嗅覺受體有4個， 分別是275288.OR230、3267.OR361、7812.OR322、GL486090.fa_3064_4137；中等表達(10%<表達率<20%)的嗅覺受體有8個，分別是107483.OR345-3、107483.OR345-2、2061.VIR320、107483.OR345-1、GL480420.fa_10877_11839、922.OR354、14718.TAAR353、22166.TAAR354；高表達(表達率>20%)的嗅覺受體有1個，是7446.TAAR346a(選此受體為受體膜表達的陽性對照)。人源白介素8受體基因HCXCR1，從野生型HeLa細胞基因組中克隆得到；人IL-8/CXCL8蛋白，購自北京義翹神州科技有限公司，貨號：10098-HNAE-20(aa 28-99)；感受態(tài)細菌DH5α，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號：CB101；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自HyClone公司；X-treme GENE HP DNA Transfection reagent，購自羅氏公司；抗Rho-tag標簽單抗(clone 4D2)，購自Millipore公司；鈣流檢測試劑盒Fluo-4 NW Calcium Assay Kit，購自Life Technology公司；熒光素酶檢測試劑盒Steady-Glo?Luciferase Assay System，購自Promega公司。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Eppendorf公司)；熒光顯微鏡Observer.Z1(卡爾蔡司公司)；酶標儀SYNERGY2(BioTeK公司)；鈣流工作站FlexStation3(Molecular Devices公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)HEK293T細胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%滅活胎牛血清，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒Lucy-Rho-pCMV-OR海七鰓鰻由本實驗室引自美國五大湖支流，由實驗動物倫理委員會密歇根州立大學動物保護管理委員會批準使用。提取海七鰓鰻的肝臟組織DNA，將其DNA作為模板，再通過海七鰓鰻的數(shù)據(jù)庫中基因信息設(shè)計引物，將Rho-tag以及Lucy-tag分別連接到pCMV-OR質(zhì)粒上，從而構(gòu)建Lucy-Rho-pCMV-OR重組質(zhì)粒。通過免疫細胞化學法(immunocytochemistry, ICC)檢測Lucy-tag對海七鰓鰻嗅覺受體膜表達的促進作用，實驗分5組：第1組，將重組質(zhì)粒Lucy-Rho-pCMV-OR、pEGFP-N1及mRTP1s進行共轉(zhuǎn)染；第2組，將重組質(zhì)粒Rho-pCMV-OR、pEGFP-N1及mRTP1s進行共轉(zhuǎn)染；第3組，只轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，用于指示轉(zhuǎn)染效率，來確定嗅覺受體的表達量是否與轉(zhuǎn)染效率相關(guān)；第4組，只轉(zhuǎn)染pCMV空載質(zhì)粒作為第3組陰性對照(即EGFP的陰性對照)；第5組，將pCMV空載和pEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，作為第1組和第2組的陰性對照(即ICC檢測受體表達的陰性對照)。其濃度均為1 mg·L-1。mRTP1s、pEGFP-N1和ORs構(gòu)成了轉(zhuǎn)染基因復合物，所使用的轉(zhuǎn)染試劑與轉(zhuǎn)染基因復合物的體積質(zhì)量比是1 ∶1(μL ∶μg)。之前的研究表明，Rho-pCMV-7446.TAAR346a在沒有Lucy-tag時，也能夠很好地表達在HEK293T細胞膜上，且表達水平較高，由此我們將Rho-pCMV-7446.TAAR346a作為固有表達受體的陽性對照組。

1.4 ICC檢測Lucy-tag對海七鰓鰻嗅覺受體膜表達的促進作用將轉(zhuǎn)染試劑與轉(zhuǎn)染復合物按照實驗量加入到無血清的培養(yǎng)液中，混勻，分別加入相應(yīng)的384孔中，在28 ℃孵育15 min后，取對數(shù)生長期HEK293T細胞，按照細胞密度的要求，將細胞接種至384孔板(5.5×103個/孔)，在含5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后12 h，更換含0.5%血清的培養(yǎng)基。24 h后，通過觀察熒光顯微鏡下細胞轉(zhuǎn)染情況，計算轉(zhuǎn)染效率。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，進行嗅覺受體膜表達檢測分析。轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉原培養(yǎng)液，用PBS(pH=7.4)洗滌細胞3次，每次2 min，用4%的多聚甲醛室溫下固定15 min，棄固定液，PBS洗滌細胞3次，每次2 min，加入封閉緩沖液(5% BSA的PBS液)封閉1 h，加入含有一抗的1% BSA的PBS封閉液，400 r·min-1離心3 min，置于70 r·min-1搖床上4 ℃孵育過夜，棄掉含有一抗的廢液，PBS洗滌3次，每次2 min，避光加入含有二抗和DAPI的1% BSA的PBS封閉液，置于搖床上室溫130 r·min-1孵育1 h，最后，PBS洗3次，每次2 min，使用熒光顯微鏡(激發(fā)光488 nm)在低倍鏡(×10)下，計算轉(zhuǎn)染效率和膜表達效率，每個實驗重復3次，求其平均值及標準差。

1.5 雙螢光素酶報告基因法檢測Lucy-tag對嗅覺受體固有活性的影響將G蛋白(Gαolf)、受體轉(zhuǎn)運蛋白(mRTP1s)、報告基因(pGL4.29)，以及所需要的質(zhì)粒Lucy-Rho-pCMV-7446.TAAR346a、Rho-pCMV-7446.TAAR346a、轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP DNA Transfection reagent按照實驗量分別加入相應(yīng)的無血清培養(yǎng)液，Rho-pCMV-7446.TAAR346a為陽性對照，Rho-pCMV和Lucy-Rho-pCMV為陰性對照。按照Log103數(shù)量級進行濃度梯度稀釋，取對數(shù)生長期HEK293T細胞，按照細胞密度的要求，將細胞接種至384孔板(7.5×103個/孔)，在含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃ 培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48 h，向每個孔內(nèi)加入10 μL的Luciferase熒光染料，用ELISA讀板，3次技術(shù)重復，以及3次生物學重復后，統(tǒng)計數(shù)據(jù)[12-13]。

1.6 鈣流法檢測Lucy-tag對IP3信號通路的影響已有文獻報道[14]，人源白介素8的受體基因與HCXCR1之間有明確的鈣流激活關(guān)系。因此，購買商品化的人源白介素8蛋白，從HeLa細胞克隆其受體基因HCXCR1作為鈣流檢測的陽性對照，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒Rho-pCMV-HCXCR1和Lucy-Rho-pCMV-HCXCR1，即一組只帶Rho-tag，另一組帶Rho-tag和Lucy-tag雙標簽，將其轉(zhuǎn)染到HEK239T細胞上進行表達，對于表達成功的Rho-pCMV-HCXCR1和Lucy-Rho-pCMV-HCXCR1用于鈣流檢測。

2 結(jié)果

2.1 Lucy-tag對海七鰓鰻嗅覺受體膜表達的促進作用通過ICC檢測Lucy-tag對海七鰓鰻嗅覺受體膜表達的促進作用，計算綠色熒光細胞與總細胞數(shù)目的比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論目的基因上是否帶有Lucy-tag，其轉(zhuǎn)染效率均為30%～40%，初步說明Lucy-tag對其轉(zhuǎn)染效率不產(chǎn)生影響(Fig 1)。然而，通過計算紅色熒光細胞與總細胞數(shù)目的比值，發(fā)現(xiàn)當目的基因N端Rho-tag前修飾Lucy-tag時，20個嗅覺受體基因中，共有13個嗅覺受體的膜表達效率有不同程度的提高，其提高程度從高至低依次為：GL486090.fa_3064_4137、2594.TAAR340、22166.TAAR354、7812.OR322、3267.OR408、GL478569.fa_174252_175250、14718.TAAR353、GL480420.fa_10877_11839、922.OR354、3267.OR361、7446.TAAR346a、275288.OR230、7446.TAAR346b。這13個嗅覺受體包括4個只有Rho-tag修飾時不表達的受體，4個只有Rho-tag修飾時低表達率受體，4個只有Rho-tag修飾時中表達率受體，1個只有Rho-tag修飾時高表達率受體。3個嗅覺受體13499.OR262、GL476599.fa_247108_248121-R、1681.OR230膜表達效率不受Lucy-tag的影響。4個嗅覺受體2061.V1R320、107483.OR345-3、107483.OR345-1、107483.OR345-2的膜表達效率有所下降(Fig 2、Tab 1)，說明了Lucy-tag對海七鰓鰻大部分嗅覺受體具有明顯的促進作用。

Fig 1 The transfection effect of sea lamprey (Petromyzon marinus) olfactory receptor on HEK293T cell membrane surface

Fig 2 The expression effect of sea lamprey(Petromyzon marinus) olfactory receptor on HEK293T cell membrane surface

2.2 Lucy-tag對嗅覺受體固有活性無影響為進一步了解Lucy-tag在促進海七鰓鰻嗅覺受體膜表達的同時，是否影響了受體的固有活性，我們將重組質(zhì)粒Lucy-Rho-pCMV-7446.TAAR346a以及Rho-pCMV-7446.TAAR346a進行轉(zhuǎn)染，其中Rho-pCMV和Lucy-Rho-pCMV為陰性對照，48 h后統(tǒng)計結(jié)果顯示，Lucy-tag對嗅覺受體的固有活性無明顯影響(Fig 3)。

Tab 1 Trafficking of olfactory receptors in absence and presence of Lucy-tag

-：No detectable OR surface expression; +：OR surface expression detected in the majority of fields of view (>20% of all fields of view); *:OR surface expression detected in the majority of fields of view (<15% of all fields of view).

Fig 3 Effect of Lucy-tag on intrinsic activity of

X axis represents the transfection concentration gradient of the olfactory receptor ofPetromyzonmarinus, Y axis represents the fluorescence signal value of the olfactory receptor ofPetromyzonmarinus. Blue curve: Rho-pCMV, Violet curve: Lucy-Rho-pCMV.

2.3 Lucy-tag對IP3信號通路無影響用鈣流工作站(FlexStation3)檢測過表達Lucy-Rho-pCMV-HCXCR1和Rho-pCMV-HCXCR1的HEK293T細胞，在HCXCL8蛋白刺激下細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，未轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞以Hank's平衡鹽溶液刺激為陰性對照。Fig 4結(jié)果顯示，在30～35 s時(加樣后第13～18 s)，Lucy-Rho-pCMV-HCXCR1實驗組(HCXCR1-PLR，藍色曲線)較Rho-pCMV-HCXCR1實驗組(HCXCR1-PR，紅色曲線)出現(xiàn)更高的峰值，陰性對照組無反應(yīng)。說明在相等的細胞數(shù)量下，HCXCR1在相同劑量的同源配體白介素8重組蛋白的刺激下，是由于受體的表達量升高，引起HEK293T細胞對配體的反應(yīng)增強。因而說明Lucy-tag促進了人白介素-8的受體CXCR1的膜表達，進一步表明Lucy-tag在促進受體表達的效率上具有重要作用，也進一步說明Lucy-tag在促進受體的膜表達的同時，并不影響IP3的信號通路。

Fig 4 Effect of Lucy-tag on IP3 signaling pathway n=3)

X axis represents detection time, Y axis represents the fluorescence signal value of calcium ions in cells, and the black arrow represents the sample being stimulated on 17th second. Blue curve: HCXCL8 stimulated Lucy-Rho-pCMV-HCXCR1; Red curve: HCXCL8 stimulated Rho-pCMV-HCXCR1; Green curve: Assay buffer stimulated wild type HEK293T cell.

3 討論

本研究利用一段富含亮氨酸的跨膜蛋白Lucy-tag，將海七鰓鰻的嗅覺受體進行修飾，構(gòu)建了重組質(zhì)粒Lucy-Rho-pCMV-OR，在20個嗅覺受體中，不同程度地促進了13個海七鰓鰻嗅覺受體在HEK293T細胞膜表面的表達，這為嗅覺受體蛋白的正確定位，探究其基因表達機制提供了前提和基礎(chǔ)。為篩選和鑒定嗅覺受體基因提供了技術(shù)手段，為進一步開發(fā)新的藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

哺乳動物嗅覺受體的異源細胞表達系統(tǒng)較為成熟，而海七鰓鰻嗅覺受體的異源細胞表達系統(tǒng)的研究并不充分。基于本課題組前期的研究結(jié)果，即使海七鰓鰻嗅覺受體的N端修飾有Rho-tag，61個嗅覺受體中仍然有7個不表達，4個低表達，說明Rho-tag并非對所有的嗅覺受體的膜表達都有效。我們利用Lucy-tag大大提高了這些不能被Rho-tag很好修飾表達的嗅覺受體膜表達效率。但是仍然有一些嗅覺受體不能很好地表達，引起嗅覺受體膜表達的因素很多，包括嗅覺受體轉(zhuǎn)運蛋白、細胞系、抗體特異性、密碼子偏好性、GC含量、氨基酸突變、標簽電荷性質(zhì)等。由于缺少海七鰓鰻的嗅覺受體轉(zhuǎn)運蛋白的同源基因和相應(yīng)的細胞系，實驗中使用的依然是小鼠的受體轉(zhuǎn)運蛋白和人胚腎HEK293T細胞系，因此會對七鰓鰻嗅覺受體的表達有一定的影響，具體原因有待進一步研究。受體的固有活性與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，并且受體的固有活性會隨其在細胞中表達量的增加而增加[2]。我們將帶有Lucy-tag的海七鰓鰻嗅覺受體STIG_7446.TAAR346a進行其固有活性探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lucy-tag對海七鰓鰻嗅覺受體STIG_7446.TAAR346a并不產(chǎn)生明顯影響。另外，通過鈣流實驗發(fā)現(xiàn)，Lucy-tag也不影響HCXCR1和HCXCL8相互作用的IP3信號通路，這為研究GPCR固有活性提供了新思路。因此，我們認為，Lucy-tag不影響嗅覺受體的功能，其有良好的標記應(yīng)用潛力。

(致謝：本實驗嗅覺受體的篩選工作完成于美國密歇根州立大學漁業(yè)與野生生物系，分析鑒定處理工作的完成得到本實驗室同學的幫助，感謝上海海洋大學季策、周澤斌等同學的工作。)